支原体耐药性变迁管理论文

［摘要］目的：了解我院临床标本分离的支原体耐药性变迁，更好地指导临床合理用 药。方法：对 2004 年至 2006 年就诊的可疑非淋菌性阴道炎(NGU)NGU))患者进行支原体的培 养及药敏检测，并随机抽取 2004 年 369 例，2005 年和 2006 年各 500 例进行耐药变迁 分析。结果：交沙霉素(NGU)JOS))和原始霉素(NGU)PRI)3)3 年中的耐药率均<10%，喹诺酮类药物氧 氟沙星(NGU)OFL))和环丙沙星(NGU)CI)3P)的耐药率呈较高水平。大环内酯类药物 AZI)3 和 ERY 耐药率较 高，尤其在解脲脲原体(NGU)U)u)+)+人型支原体(NGU)Mh))混合感染中，喹诺酮类和大环内酯类的耐药 率均在持续高水平状态，TET 在混合感染中耐药率显著上升。结论：强力霉素 (NGU)DOT)、JOS) 和 PRI)3 为治疗支原体的首选药物，但应定期监测支原体的耐药性变迁。 ［关键词］解脲脲原体；人型支原体；耐药性；监测 解脲脲原体(NGU)U)u)+)和人型支原体(NGU)Mh))是导致非淋菌性尿道炎(NGU)NGU))最常见病原体之一， 近年来其感染率上升很快，病原体耐药亦逐年增加。为了了解我院临床分离的支原体对常 用抗生素的耐药性变迁，我们对本院 2004 年至 2006 年 5 月分离的支原体进行药敏试验， 并随机抽取一部分进行耐药性变迁的分析，现将结果报告如下。 1 标本与方法 1.1 标本来源 2004 年至 2006 年 5 月来院门诊妇科患者，随机抽取 2004 年 369 例， 2005 年 500 例，2006 年 1 月至 6 月 500 例。 1.2 标本采集女性患者取宫颈分泌物：先用无菌棉签拭去宫颈口分泌物，然后用一次 性女用拭子伸入宫颈口 12cm～14cm 处停留 10s～20s，旋转 2 圈～3 圈，取出标本立 即送检。 1.3 试剂与方法支原体 I)3S)T22 试剂盒(NGU)法国生物梅里埃公司生产)；包被抗生素：强力 霉素(NGU)DOT)、交沙霉素(NGU)JOS))、氧氟沙星(NGU)OFL))、红霉素(NGU)ERY)、四环素(NGU)TET)、环丙沙星 (NGU)CI)3P)、阿奇霉素(NGU)AZI)3)、克拉霉素(NGU)CL)A)、原始霉素(NGU)PRI)3)，严格按试剂说明书操作。 2 结果 2.1 支原体药敏试验结果 3 年中 U)u)+ 单项感染 PRI)3 耐药率为＜0.5%，DOT、TET 均＜ 10%，CI)3P 耐药率最高，＞82.8%；U)u)+ 和 Mh) 混合感染中，2004 年组 PRI)3 为 0；2005 年 JOS)、PRI)3 为 0；2006 年组 PRI)3 为 0。耐药率最高的是：2004 年 ERY(NGU)96.8%)、CI)3P(NGU)96.8%)，2005 年 CI)3P(NGU)93.3%)，2006 年 CI)3P(NGU)92.0%)。2004 年至 2006 年 U)u)+、U)u)++Mh) 耐药率见表 1 和表 2： 2.2U)u)+ 耐药率的变迁 JOS)、PRI)3、DOT3 年中耐药率最低(NGU)＜8%)，中敏率(NGU)＜5%)；大 环内酯类 ERY、AZI)3 的耐药率在 20%～30%之间；CL)A2004 年 6.5%，到 2005 年至 2006 年分别高达 31.6%和 26.0%，喹诺酮类药物 OFL)、CI)3P3 年的耐药率均处于最高水 平。 2.3U)u)++Mh) 混合感染耐药性变迁 PRI)33 年中耐药率为 0，JOS) 和 DOT 耐药率略有上 升，但小于 10%；TET 耐药率逐年上升，分别为 6.5%、15.0%、34.0%(NGU)P＜0.01)。大 环内酯类(NGU)ERY、AZI)3、CI)3A)耐药率呈逐年下降；喹诺酮类(NGU)OFL)、CI)3P)3 年中均呈高耐水平。 3 讨论 支原体是一种缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过细菌滤菌器、在无生命培养基中能 生长的最小原核型微生物，U)u)+ 和 Mh) 主要寄生于人体泌尿生殖道，可引起急性尿道综合征、 NGU)、肾盂肾炎、阴道炎、盆腔炎、不育症、死产、早产及低出生体重儿、羊膜绒毛膜炎、 流产热和产后热［1］，有文献报道，U)u)+ 是引起 NGU) 的重要病原体［2］，也是引起不孕 的重要原因［3］。由于支原体没有固定的细胞壁，因此对干扰细胞壁形成的 β2内酰胺类 和头孢类天然耐药，而对抑制蛋白合成的抗生素敏感，如四环素类、大环内酯类 (NGU)ERY、AZI)3)和喹诺酮类 OFL)、CI)3P 药物，TET 类抗生素能阻止氨酰基与核糖核酸结合，从 而阻碍肽链增长和蛋白质合成，对支原体有很好疗效。本文显示单项 U)u)+ 感染者，TET 的 耐药率都在 10%以下，U)u)++Mh) 混合感染者，3 年中的耐药率显著上升，这可能与我院近 年使用该药物频繁有关。随着不规范的治疗和不合理使用抗生素，U)u)+ 和 Mh) 在抗生素的选 择压力下，通过某些基因如 DNA 促旋酶的突变，不断出现新的耐药株，而且不同地区使 用抗生素的频率不同，耐药率亦有所差异。结果显示，3 年中 U)u)+ 单项感染患者中， DOT、JOS)、TET、PRI)3 均维持在低耐药水平，喹诺酮类(NGU)OFL)、CI)3P)和 ERY、AZI)33 年耐药 率均持续在高水平，而阿奇霉素 3 年中耐药率呈明显上升。U)u)++Mh) 混合感染 3 年的耐药 率变化为：DOT、JOS)、PRI)3 同 U)u)+ 单项感染一致，维持在较低耐药水平，但喹诺酮类 OFL) 和 CI)3P 的耐药率高达 70%以上，大环内酯类红霉素、阿奇霉素和克拉霉素也高达 64%～97%。原因可能与临床未能及时选用敏感药物及给药剂量不足、疗程不够，以致不 能彻底治愈，使不敏感药物，低浓度药物与支原体长期接触，诱导支原体耐药基因产生有 关［4］。随着抗生素的广泛应用，支原体耐药株日益增多，并出现了支原体多重耐药现 象，而支原体一旦出现耐药，就有可能是多重耐药菌株［5］，尤其是 U)u)++Mh) 混合感染 者。因此，对临床有症状患者应根据支原体培养结果，确定有否混合感染，再选择药物治 疗，避免滥用，以提高疗效和治愈率［6］。有文献报道，用多西环素和阿奇霉素同时服 用，总有效率达 96.8%,取得很好疗效［7］。总之，U)u)++Mh) 在不同时期，不同地区的耐 药性有很大差异，提示我们应对本地区的支原体耐药性定期进行监测，严防抗生素的滥用。 ［摘要］目的：合成(NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+2Eu)+3+复合物，并用于构建妊娠 相关血浆蛋白 A 固相时间分辨免疫荧光试剂。方法：用 PVA 作为载体结合 BCPDA2Eu)+3+ 和生物素2亲和素，以双抗体夹心法原理，结合生物素标记抗体和包被抗体建立 PAPP2A 时 间分辨免疫荧光试剂，并进行方法学评价。结果：成功的合成了活性的 (NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+2Eu)+3+复合物，构建 PAPP2A 试剂检测灵敏度为 0.7mI)3U)/ L)；批内变异系数在 3.89%～4.96%之间,批间变异系数在 7.35%～9.27%之间。结论： 合成的(NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+2Eu)+3+复合物较高的反应活性，可以用于多种试剂的 构建。构建的 PAPP2A 试剂灵敏度高，具有潜在的临床应用价值。 ［关键词］妊娠相关血浆蛋白 A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素—生物素—聚乙烯 胺—4,7 二氯磺苯基21，10 啡罗啉22，9 二羧酸—铕复合物；唐氏综合征 Develo)xPVA(BCPDA)yEu3+pADirectS)o)xPVA(BCPDA)yEu3+lidPh)aseL)anth)aneTime2reso)xPVA(BCPDA)yEu3+lvedFlu)+o)xPVA(BCPDA)yEu3+ro)xPVA(BCPDA)yEu3+immu)+no)xPVA(BCPDA)yEu3+assayEu3+Rea gento)xPVA(BCPDA)yEu3+fPAPP2Au)+tiliz(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ingPVA Abstract:ObjectiveTo)xPVA(BCPDA)yEu3+develo)xPVA(BCPDA)yEu3+padirectso)xPVA(BCPDA)yEu3+lidph)aselanth)anetime 2reso)xPVA(BCPDA)yEu3+lvedflu)+o)xPVA(BCPDA)yEu3+r o)xPVA(BCPDA)yEu3+immu)+no)xPVA(BCPDA)yEu3+assayEu3+reagento)xPVA(BCPDA)yEu3+fPAPP2AbyEu3+syEu3+nth)esiz(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ingaco)xPVA(BCPDA)yEu3+mplexPVA(BCPDA)yEu3+o)xPVA(BCPDA)yEu3+f(NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)B CPDA)yEu3+2Eu)+3+.Meth)o)xPVA(BCPDA)yEu3+dsPo)xPVA(BCPDA)yEu3+lyEu3+vinyEu3+lamine(NGU)PVA)waslabeledwith)bio)xPVA(BCPDA)yEu3+tin 2streptavidina ndeu)+ro)xPVA(BCPDA)yEu3+piu)+mch)elateo)xPVA(BCPDA)yEu3+f4,72bis(NGU)ch)lo)xPVA(BCPDA)yEu3+ro)xPVA(BCPDA)yEu3+su)+lfo)xPVA(BCPDA)yEu3+ph)enyEu3+l)21,102ph)enanth)ro)xPVA(BCPDA)yEu3+line 22,9 2dicar bo)xPVA(BCPDA)yEu3+xPVA(BCPDA)yEu3+yEu3+lic2acid(NGU)BCPDA).U)singlabeledPVAco)xPVA(BCPDA)yEu3+mplexPVA(BCPDA)yEu3+,Wedesignedtwo)xPVA(BCPDA)yEu3+2sitesandwich)ti me2reso)xPVA(BCPDA)yEu3+lvedflu)+o)xPVA(BCPDA)yEu3+ro)xPVA(BCPDA)yEu3+immu)+no)xPVA(BCPDA)yEu3+assayEu3+o)xPVA(BCPDA)yEu3+fPAPP2Aandevalu)+atedassayEu3+ch)aracteristicso)xPVA(BCPDA)yEu3+fP APP2Akit.Resu)+ltsWesu)+ccessedsyEu3+nth)esiz(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ingaco)xPVA(BCPDA)yEu3+nju)+ageteo)xPVA(BCPDA)yEu3+f(NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA 2(NGU)BCP DA)yEu3+2Eu)+3+andareagento)xPVA(BCPDA)yEu3+fPAPP2A.Detectio)xPVA(BCPDA)yEu3+nlimitsach)ievedwere0.7mI)3U)/ L).Th)ecalibratio)xPVA(BCPDA)yEu3+ncu)+rvewaslinear0210000mI)3U)/ L).I)3ntra2andinterassayEu3+imprecisio)xPVA(BCPDA)yEu3+n(NGU)CV)was3.89%24.96%and7.35%29.27%.Reco)xPVA(BCPDA)yEu3+v eryEu3+was95.8%2104.2%.Co)xPVA(BCPDA)yEu3+nclu)+sio)xPVA(BCPDA)yEu3+nsTh)eco)xPVA(BCPDA)yEu3+nju)+gateo)xPVA(BCPDA)yEu3+f(NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA 2(NGU)BCPDA)yEu3+ 2E u)+3+syEu3+nth)esiz(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+iedwasreactive,h)igh)lyEu3+fo)xPVA(BCPDA)yEu3+u)+o)xPVA(BCPDA)yEu3+rescent.Aso)xPVA(BCPDA)yEu3+rtso)xPVA(BCPDA)yEu3+fkitco)xPVA(BCPDA)yEu3+u)+ldbesyEu3+nth)esiz(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ed ,takingadvantageo)xPVA(BCPDA)yEu3+fit.Th)ereagento)xPVA(BCPDA)yEu3+fPAPP2Awaspo)xPVA(BCPDA)yEu3+tentiallyEu3+su)+itedfo)xPVA(BCPDA)yEu3+ru)+seinclinical with)h)igh)lyEu3+analyEu3+ticalsensitivityEu3+. KeyEu3+wo)xPVA(BCPDA)yEu3+rds:PregnancyEu3+asso)xPVA(BCPDA)yEu3+ciatedplasmapro)xPVA(BCPDA)yEu3+teinA;Directso)xPVA(BCPDA)yEu3+lidph)aselanth)anet ime2reso)xPVA(BCPDA)yEu3+lvedflu)+o)xPVA(BCPDA)yEu3+ro)xPVA(BCPDA)yEu3+immu)+no)xPVA(BCPDA)yEu3+assayEu3+;S)treptavidin2bio)xPVA(BCPDA)yEu3+tin2Po)xPVA(BCPDA)yEu3+lyEu3+vinyEu3+lamine2eu)+ro)xPVA(BCPDA)yEu3+piu)+m ch)elateo)xPVA(BCPDA)yEu3+f4,72bis(NGU)ch)lo)xPVA(BCPDA)yEu3+ro)xPVA(BCPDA)yEu3+su)+lfo)xPVA(BCPDA)yEu3+ph)enyEu3+l)21,102ph)enanth)ro)xPVA(BCPDA)yEu3+line22,92dicarbo)xPVA(BCPDA)yEu3+xPVA(BCPDA)yEu3+yEu3+lic2acid; Do)xPVA(BCPDA)yEu3+wn''''sS)yEu3+ndro)xPVA(BCPDA)yEu3+me 妊娠相关血浆蛋白 A(NGU)PregnancyEu3+asso)xPVA(BCPDA)yEu3+ciatedplasmapro)xPVA(BCPDA)yEu3+teinA，PAPP2A)是一种高 分子 α2 糖蛋白，20 世纪 70 年代在孕妇血清中被发现［1］。在孕妇血中主要 PAPP2A 是 胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为 200000~250000 亚基构 成。PAPP2A 亚基和两个嗜红细胞主要基础蛋白 (NGU)Pro)xPVA(BCPDA)yEu3+fo)xPVA(BCPDA)yEu3+rmo)xPVA(BCPDA)yEu3+feo)xPVA(BCPDA)yEu3+sino)xPVA(BCPDA)yEu3+ph)ilmajo)xPVA(BCPDA)yEu3+rbasicpro)xPVA(BCPDA)yEu3+tein)以二硫键结合而成［2］，在孕妇血中只存在 微量游离单体 PAPP2A。PAPP2A 亚基由 1547 个多聚核苷酸构成，包括 1 个拉长的锌指结 构，3 个 L)in—no)xPVA(BCPDA)yEu3+tch) 重复序列，以及 5 个短一致重复序列［3］。在体内 PAPP2A 是一种 蛋白酶，主要针对胰岛素样生长因子结合蛋白 4(NGU)I)3GFBP24)和胰岛素样生长因子结合蛋白 5(NGU)I)3GFBP25)起作用。胰岛素样生长因子 I)3(NGU)I)3GF2I)3)在促进细胞分裂和增殖起重要作用，它主 要通过 I)3GF21 受体起作用，I)3GF2I)3、I)3I)3 的生物活性受 6 个高亲和性 I)3DFBP 调节 ［4，5］。PAPP2A 主要用于产前筛查唐氏综合征(NGU)Do)xPVA(BCPDA)yEu3+wn''''sS)yEu3+ndro)xPVA(BCPDA)yEu3+me，DS))，迄今医 学上对此病尚无有效的治疗和预防措施，只能通过产前筛查防止 DS) 儿的出生，但目前开 展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵入性检查,有 1%～3%的流产率,且方法繁琐, 出报告时间长,不适宜大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。大量报道认为 PAPP2A 可作为 DS) 胎儿产前筛查的的标志物。在 15 周～20 周通过结合孕妇孕周、超声诊断和 Freeβ2HCG 可以鉴别 65%～75%，但要在 3 个月～6 个月结合 AFP、游离 E3 以及抑制 素上述成分可鉴别 85%～90%［6］。有文献［7］报道 PAPP2A 在急性冠状动脉综合征 (NGU)ACS))的早期诊断有一定的意义，PAPP2A 在 ACS) 患者血清含量＜30mI)3U)/L)，同时结构不 同于孕妇体内的 PAPP2A 且存在动态变化，必须利用超灵敏的方法进行检测。国内 PAPP2A 的诊断试剂大多为 EL)I)3S)A 和 PerkinElmer 公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫 分析(NGU)disso)xPVA(BCPDA)yEu3+ciatedenh)ancelanth)anetime2reso)xPVA(BCPDA)yEu3+lvedflu)+o)xPVA(BCPDA)yEu3+ro)xPVA(BCPDA)yEu3+immu)+no)xPVA(BCPDA)yEu3+assayEu3+,DEL)FI)3A) 试 剂，无国产 PAPP2A 时间分辨荧光试剂。我们利用 PVA(NGU)聚乙烯胺)作为载体结合 BCPDA 镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫分析 (NGU)directso)xPVA(BCPDA)yEu3+lidph)aselanth)anetimereso)xPVA(BCPDA)yEu3+lvedflu)+o)xPVA(BCPDA)yEu3+ro)xPVA(BCPDA)yEu3+immu)+no)xPVA(BCPDA)yEu3+assayEu3+,DS)L)FI)3A)试剂。为提 高检测灵敏度和克服 BCPDA 标记抗体使抗体失活的问题，我们引入了生物素2亲和素 (NGU)bio)xPVA(BCPDA)yEu3+tin2streptavidinsyEu3+stem)系统。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 试剂 4,7 二氯磺苯基21，10 啡罗啉22，9 二羧酸 ［4,72bis(NGU)ch)lo)xPVA(BCPDA)yEu3+ro)xPVA(BCPDA)yEu3+su)+lfo)xPVA(BCPDA)yEu3+ph)enyEu3+l)21,102ph)enanth)ro)xPVA(BCPDA)yEu3+line22,92dicarbo)xPVA(BCPDA)yEu3+xPVA(BCPDA)yEu3+yEu3+licacid,BCPDA 自制］；纯化亲和素(NGU)S)treptavidin，S)A，S)igma 公司)；硫代琥珀酰亚氨26 生物素氨基2 己酯类 ［S)u)+lfo)xPVA(BCPDA)yEu3+su)+ccinimidyEu3+l26''''2(NGU)bio)xPVA(BCPDA)yEu3+tinamido)xPVA(BCPDA)yEu3+)262h)exPVA(BCPDA)yEu3+anamido)xPVA(BCPDA)yEu3+h)exPVA(BCPDA)yEu3+ano)xPVA(BCPDA)yEu3+ate ，S)u)+lfo)xPVA(BCPDA)yEu3+2NHS)2L)C 2L)C2Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+tin，pierceCh)emicalCo)xPVA(BCPDA)yEu3+mpanyEu3+］；聚乙烯胺氢氯化物 (NGU)Po)xPVA(BCPDA)yEu3+lyEu3+vinyEu3+lamineh)yEu3+dro)xPVA(BCPDA)yEu3+ch)lo)xPVA(BCPDA)yEu3+ride，PVA,Ch)emicalDyEu3+namicsCo)xPVA(BCPDA)yEu3+rp)；硼酸钠、二甲亚砜 (NGU)天津化学试剂有限公司)；单克隆抗体根据文献［5］选择 HyEu3+b234— 5(NGU)S)tatensseru)+mI)3nstitu)+t)作为检测抗体，mAb10E1(NGU)HyEu3+TestOyEu3+，Finland)作为捕获抗 体；PAPP2A 标准品和质控品购于 PE 公司(NGU)质控血清：Co)xPVA(BCPDA)yEu3+ntro)xPVA(BCPDA)yEu3+l1508mI)3U)/ L)，Co)xPVA(BCPDA)yEu3+ntro)xPVA(BCPDA)yEu3+l22325mI)3U)/L)，Co)xPVA(BCPDA)yEu3+ntro)xPVA(BCPDA)yEu3+l3 为 4952mI)3U)/L))；鼠 I)3gG(NGU)晶美公司)。 1.1.2 仪器 Wallac21420 多标记计数仪(NGU)WallacOY，Finland)；HPL)C 硅柱 TS)K2250 尺寸排阻柱(NGU)BI)3O2RAD 公司)；96 白色微孔板(NGU)NU)NC 公司)、亲和素包被板 (NGU)I)3nno)xPVA(BCPDA)yEu3+tracDiagno)xPVA(BCPDA)yEu3+sticsOyEu3+ 公司)；Amico)xPVA(BCPDA)yEu3+n 可浓缩离心管 (NGU)Amico)xPVA(BCPDA)yEu3+nmicro)xPVA(BCPDA)yEu3+co)xPVA(BCPDA)yEu3+ncentratio)xPVA(BCPDA)yEu3+nu)+nits，MW30000Cu)+t2o)xPVA(BCPDA)yEu3+ff)) 1.2 方法 1.2.1BCPDA 的制备参见文献详细步骤［8～10］。 1.2.2 生物素2聚乙烯胺2BCPDA［(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+］复合物的构建［11］用 0.5M 的碳酸盐(NGU)pH9.1)缓冲液配制浓度为 10mg/ml 聚乙烯胺(NGU)PVA)溶液，将 200μgNHSLCLCBiotingNHS)2L)C2L)C2Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+tin 溶于 20μgNHSLCLCBiotinl 碳酸盐缓冲液中，取 200μgNHSLCLCBiotinl 上述 PVA 溶液加入 20μgNHSLCLCBiotinl 上述 NHS)2L)C—L)C2Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+tin 溶液中，振荡混匀，室温反应 1.5h)(NGU)PVA∶Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+=1∶15)，用 0.5M 碳酸盐缓冲液将混合液稀释到 1ml，将固体 BCPDA 研磨成粉末状，先在上述 1ml 混合液中加入 5mgBCPDA，用力搅拌，直到溶解，重复加 3 次 BCPDA，5mg/次，共计 20mgBCPDA，在室温放置 5h)～6h)，直到溶液澄清，转移到透析袋中，用 0.1MNaHCO35L) 透析、过夜、重复透析 2 次，尽可能除去没反应的 BCPDA 和生物素。 1.2.3HPL)C 纯化(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+ 复合物离心浓缩上述 (NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+ 复合物到 0.3ml～0.5ml(NGU)用 Amico)xPVA(BCPDA)yEu3+nmicro)xPVA(BCPDA)yEu3+co)xPVA(BCPDA)yEu3+ncentratio)xPVA(BCPDA)yEu3+nu)+nits，MW30000Cu)+t2o)xPVA(BCPDA)yEu3+ff))。流动相 0.05MTris 缓冲液 (NGU)pH7.70)，控制 HPL)C 流速 0.8ml/min，在 325nm 处监测层析液(NGU)325nm 为 BCPDA 最 大吸收峰)，上样后，马上收集，(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+ 在 10 管～16 管约 5ml 左右，取 10μgNHSLCLCBiotinl(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+ 层析液加入 90μgNHSLCLCBiotinl 水滴入亲和素包被板微孔中，温育 30min，洗板，加入用 Tris 缓冲液配制的 10M～5MEu)+Cl3100μgNHSLCLCBiotinl，反应 10min，洗板、 干燥，用 Wallac21420 检测 Eu)+3+的荧光强度，没结合复合物的被洗去了，没结合 BCPDA 的复合物因无法结合 Eu)+3+而没有荧光，计算标记的 PVA，大约每分子结合 50 个～100 个 BCPDA 分子。 1.2.4 构建亲和素2生物素2PVA2BCPDA［(NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+2Eu)+3+］复 合物［11］用 0.1MTris 缓冲液(NGU)pH7.8)配制小牛血清白蛋白(NGU)BS)A 溶液)60g/L)，同时加入 Eu)+Cl3，使 Eu)+3+浓度为 10-6mo)xPVA(BCPDA)yEu3+l/ml，用双蒸水配制亲和素溶液浓度为 1mg/ml，取上 述 BS)A 溶液 1ml，加入 10μgNHSLCLCBiotinl 亲和素溶液，再加入 50μgNHSLCLCBiotinl 的(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+ 复合物 (NGU)通过固相免疫分析，棋盘滴定法确定最佳用量比，步骤略，结果见后)，混匀，55℃温育 1.5h)，4℃保存备用。 1.2.5(NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+2Eu)+3+复合物反应活性用生物素化的各种浓度 (NGU)0ng/50μgNHSLCLCBiotinl，0.5ng/50μgNHSLCLCBiotinl，5ng/50μgNHSLCLCBiotinl，50ng/50μgNHSLCLCBiotinl，100ng/50μgNHSLCLCBiotinl)鼠 I)3gG 包被 96 孔微 板(NGU)同第 7 步)，用 60g/L)BS)A 和 0.1mo)xPVA(BCPDA)yEu3+l/L)Tris 缓冲液(NGU)pH7.8)10 倍稀释 (NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+2Eu)+3+复合物，在板的微孔中加入 100μgNHSLCLCBiotinl 稀释后的 (NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+2Eu)+3+复合物，室温反应 30min，洗板、干燥，测量荧光 强度(NGU)cpm)。本实验是验证复合物的反应活性。 1.2.6 生物素标记 10E1 抗体［12］用二甲亚砜制备硫代琥珀酰亚氨26 生物素氨基2 乙酯溶液(NGU)10mg/ml)，将抗体 10E1 溶于 0.1mo)xPVA(BCPDA)yEu3+l/L) 硼酸钠溶液(NGU)pH8.8)，每 1mg 抗体中 加硫代琥珀酰亚氨26 生物素氨基2己酯类溶液 210μgNHSLCLCBioting 混合，室温放置 4h)，在上述溶液中 加入 20ml1mo)xPVA(BCPDA)yEu3+l/L)NH4Cl，室温反应 10min，将反应液进行透析，除去未结合的生物素， 将抗体浓度用分析缓冲液配置成 8ng/μgNHSLCLCBiotinl，-20℃保存备用。 1.2.7 单克隆 HyEu3+b234—5 抗体包被 96 孔微滴定板将抗体溶于 0.1M 磷酸盐缓冲液 (NGU)pH4.9)，配置成 5μgNHSLCLCBioting/ml 抗体溶液，在每一孔中加入 80μgNHSLCLCBiotinl 抗体溶液，室温反应 20h)，然 后用生理盐水洗 3 次，然后每孔加 120μgNHSLCLCBiotinl0.05MTris2Hcl 缓冲液(NGU)pH7.4 含 0.9%生理盐水、 0.05%NaN3、0.5%小牛血清白蛋白 BS)A)浸泡 2h)。吸干缓冲液，干燥，密封 4℃保存。 1.2.8 样本收集、定标、灵敏度、精密度和回收实验分析过程选取怀孕 8 周、9 周、 11 周妇女血清各一份，经 PE 公司的 DEL)FI)3A 试剂和 D&G 公司的 EL)I)3S)A 试剂多次精确测 定，值分别为：P1863.27mI)3U)/L)；P21273.63mI)3U)/L)；P32727.23mI)3U)/L)。用标准品稀 释液(NGU)6%BS)A2TS)A 缓冲液：150mmo)xPVA(BCPDA)yEu3+l/L)NaCl、60g/L)BS)A、50mmo)xPVA(BCPDA)yEu3+l/ L)Tris2HCl，pH7.8)将标准品稀释浓度为：S)00mI)3U)/L)(NGU)稀释液)、S)120mI)3U)/ L)、S)2200mI)3U)/L)、S)31000mI)3U)/L)、S)45000mI)3U)/L)、S)510000mI)3U)/L)。标准品定标根据 WHOI)3RP78/610(NGU)WHOI)3nternatio)xPVA(BCPDA)yEu3+nalL)abo)xPVA(BCPDA)yEu3+rato)xPVA(BCPDA)yEu3+ryEu3+fo)xPVA(BCPDA)yEu3+rBio)xPVA(BCPDA)yEu3+lo)xPVA(BCPDA)yEu3+gicalstandards，S)tatensS) eru)+minstitu)+t，Denmark)，单位换算：1000mI)3U)/L)=4.5μgNHSLCLCBioting/ml。在单克隆 HyEu3+b234— 5 抗体包被 96 孔微滴定板，每孔加入定标液 10μgNHSLCLCBiotinl，作 8 次平行测量，加入 50μgNHSLCLCBiotinl 生物素标 记 10E1 抗体 50μgNHSLCLCBiotinl，混匀，36℃，室温反应 20min，洗板 6 次，加入 100μgNHSLCLCBiotinl10 倍稀释 的(NGU)S)A)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+2(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+2Eu)+3+复合物，室温反应 25min，洗板 6 次，吹干， Wallac21420 测量荧光强度(NGU)cpm)，取均值，作标准曲线。将 S)00mI)3U)/L) 做 20 次重复测 试，计算均值(NGU)X))和标准差(NGU)s)，以 X)+2s 为试剂的最小检测限。将 Co)xPVA(BCPDA)yEu3+ntro)xPVA(BCPDA)yEu3+l1，Co)xPVA(BCPDA)yEu3+ntro)xPVA(BCPDA)yEu3+l2，Co)xPVA(BCPDA)yEu3+ntro)xPVA(BCPDA)yEu3+l3 依据定标分析过程，同批测量 20 次，批间测量 12 次， 用于评价精密度。对收集样本(NGU)P1、P2、P3)依据定标分析过程进行测量，然后将 Co)xPVA(BCPDA)yEu3+ntro)xPVA(BCPDA)yEu3+l1、Co)xPVA(BCPDA)yEu3+ntro)xPVA(BCPDA)yEu3+l2、Co)xPVA(BCPDA)yEu3+ntro)xPVA(BCPDA)yEu3+l3 分别等体积加入 P1、P2、P3 中进行测量，用于评价回 收实验。 2 结果 2.1 用 HPL)C 纯化(NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+ 复合物在 10min～16min 出现 (NGU)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+)xPVA(BCPDA)yEu3+2PVA2(NGU)BCPDA)yEu3+ 的吸收峰，没有结合 BCPDA 的吸收峰在 17min～24min 出现,见 图 1。 图 1 净化（Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+）xPVA(BCPDA)yEu3+－聚乙烯醇（聚乙烯醇（BCPDA）yEu3+ 在高性能液化色谱（TS)K－聚乙烯醇（250 过滤 柱）上的变化图。（略） 流速控制在 0.8ml/min，吸光率 325nm