铜绿假单胞菌研究论文

［摘要］多重耐药性铜绿假单胞菌是临床抗感染治疗中的一个棘手的问题，除了外排 系统，外膜通透性障碍等天然耐药机制之外，整合子介导的多重耐药基因也是造成铜绿假 单胞菌多重耐药的主要原因之一。本文就整合子的结构与分类、基因盒的种类与表达以及 与铜绿假单胞多重耐药性的关系进行综述。 ［关键词］多重耐药性；铜绿假单胞菌；整合子；基因盒 整合子(Integron)Integron)是 1989 年由 StokesHW 等首次提出的一个与细菌耐药性传播有 关的基因系统，可捕获和整合细菌耐药基因，在细菌耐药性的传播和扩散中起了重要的作 用。质粒和转座子携带整合子增加了抗生素耐药基因在细菌之间的传播。整合子通过位点 特异性的基因重组可整合多种耐药基因对细菌多重耐药性的形成起着重要作用，整合子介 导的多重耐药基因也是造成铜绿假单胞菌多重耐药性的原因。 1 整合子的结构与种类 整合子由整合酶基因(Integron)IntI)，重组位点(Integron)attI)，1 个或 2 个负责插入基因盒表达的启动 子所组成［1］。整合子根据整合酶基因不同分为 6 种类型，但研究较为详尽的是前 4 种 类型，临床分离的多重耐药性铜绿假单胞菌主要含有Ⅰ类整合子和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合类整合子和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合类整合子。Ⅰ类整合子和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合类整合 子基本结构由三部分组成，两端是一段高度保守的序列，分别称作 5’CSCS 和 3’CSCS，5’CSCS 和 3’CSCS 之间的区域称作可变区，可变区由一个或多个外来插入的基因盒组成。5’CSCS 区有 一个编码整合酶的 IntI 基因，一个基因重组位点 attI 及启动子(Integron)P1 和 P2)。3’CSCS 包括三个 开放阅读框架：季铵盐化合物及溴乙锭耐药基因，磺胺耐药基因。基因盒由一个结构基因 和 59 碱基单元即 attC 组成［2］。Ⅰ类整合子和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合型整合子的整合酶主要催化 attI 和 attC 位点间的重 组，可将外源性耐药基因扑获并整合入整合子，两个 attC 位点间或 attI 位点间也可被催 化重组［3］;ⅡⅡ 类整合子常与 Tn7 有关［4］，基整合酶基因是缺陷的 INTI 基因，它的产 物 INTI1 的产物有 40％同源性，3 保守末端包括 5 个 tns 基因，协助转座子的移动;ⅡⅢ 类整 合子携带仅发现在一型整合子中出现的碳青霉烯类耐药性金属酶基因 blaIMP，基整合酶基 因 intI3 与 intI1 有 61％同源性;ⅡⅣ 类整合子又称为超级整合子，在霍乱弧菌基因组中首次 发现。最近假单胞菌中发现的 In5504 被认为介于多重耐药整合子与霍乱弧菌超级整合子 之间。 2 基因盒的结构和种类 基因盒由一个结构基因和 3 端的一个回文序列 attC 组成，attC 位点有 1 个 59 碱基 长的片段，所以 attC 以前被称为“59 片段”。attC 由 1 个可被整合酶识别的特异性重组位 点组成，attC 位点的长度从 576bp 到 141bp 不等［5］。迄今报道在整合子上发现几十 种耐药性基因盒，不同的基因盒有不同功能和结构，基因盒一般由一个或多个编码不同的 抗性的基因组成，包括最初发现的编码氨基糖苷类和氯霉素钝化酶的基因，编码磺胺类， β内酰胺类耐药的基因，以及近来发现的编码超谱 β内酰胺酶及碳青霉烯类水解的基因 ［6］。铜绿假单胞菌多重耐药性菌株中含有介导氨基糖苷类耐药的 aac296 基因， AAC(Integron)6)296 能紧密接合隔绝药物，而介导对抗生素的耐药性［6］，目前发现的 IMP1、VIM1、VIM2 这 3 种金属酶基因均位于Ⅰ类整合子和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合类整合子的可变区，可以在不同铜绿 假单胞菌和不同的细菌间传播，造成耐药性播散［7］，BlavEM1 是位于整合子的基因所 编码的一种 EsBL，介导铜绿假单胞对 B内酰胺类抗生素耐药。铜绿假单胞菌染色体中发 现的介导对氯霉素耐药 CatBl 基因和 CatB7 基因与 CatB2、CatB3 及 CatB5 等基因盒关 系密切［8］。 3 基因盒的表述 细菌通过整合酶的作用，捕获外来的耐药基因，并在位于整合子上游的启动因子作用 下得到表述，使细菌具有耐药性和多重耐药性［9］，由于绝大多数基因盒不含有启动因 子，自身并不能表述，因而总是以相同的方向插入整合子，且其从 5’CS保守片段中的启动因 子开始转录，整合子通过位点特异性的基因重组于整合多种耐药基因，对细菌多重耐药性 的形成起重要作用［10］。由于基因盒按照从 5’CS到 3’CS的方向整合于 attI 位点，所以启动 区可使插入其中的基因盒共表达，在整合子 5’CSCS 含有 P1 和 P2 两种启动因子，P1 是共同 启动因子，也是主要启动因子。目前发现 P1 有几种变异体，他们都有含有一段 6 个碱基 的共同序列。TTGACA(Integron)35)和 TAAACT(Integron)10)为强启动因子。少数整合子还有 P2 启动因 子，位于 P1 的下游 119 碱基处，17 碱基的 P2 变异体是强动子，当 P1 为弱变异体时， 基因盒的表达主要依赖 P2 的作用。启动因子的强弱会影响基因盒的表达水平，而且基因 盒插入整合子的位置也会影响基因盒的表达。目前研究发现，靠近启动因子的基因盒表达 水平最强，位于一个或多个其他基因盒的下游会逐渐减弱。极少数基因盒自身含有启动因 子，不依赖于 5’CSCS 的启动因子而自身可以表达。弱启动因子下游或处于基因盒下游的耐 药性基因盒在抗生素选择性压力下，有可能借助整盒酶介导的基因重组，插入到强启动因 子下或靠近 P1 的位置，从而由低水平转为高效表达，耐药性水平随之增强。 4 基因盒—整合子系统和铜绿假单胞多重耐药性 多重耐药革兰阴性杆菌特别是铜绿假单胞菌感染在全世界不断增加，临床出现的多重 耐药的铜绿假单胞菌与整合子对耐药基因的积累分不开的，整合子上常常有新的整合子结 构。它是有强的整合酶的结合位点和新的可变区结构，该可变区除有携带 VIM2 型金属酶 基因外，还携有一个新的 AACA4 等位基因，编码对氨基糖苷类抗生素的耐药性，这表明 整合子结构与基因酶的铜绿假单胞菌多重耐药的获得有关。基因盒整合子属于可移动基因 元件，可位于细菌的质粒或染色体上，能整合不同的耐药基因盒，且一个整合又可捕获多 个基因盒，因此，可表达出对抗生素的多重耐药性。Sckiguchi 等［2］对引起尿路感染 爆发的多重耐药性铜绿假单胞菌进行分析，发现多重耐药性的铜绿假单胞菌 IMCJZ。S1 菌 株存在克隆扩增，对氨基糖苷类、β内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素类、磺胺类等抗生素 具有广谱的耐药性。IMCJZ，S1 菌株含有存在于染色体而不存在质粒上新Ⅰ类整合子和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合类整合子，它 有三种耐药基因即 bla、aadal 和 aac(Integron)6’CS)Iae。Poerec 等［13］发现铜绿假单胞菌表达 超广谱 B内酰酶(Integron)GES9)基因，这种基因位于Ⅰ类整合子和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合类整合子上，介导对多种 B内酰类抗生素 的耐药性。近年来，由整合子携带多重耐药性铜绿假单胞菌引起的医院感染爆发流行，与 金属酶不断出现和编码金属酶的基因定位于整合子上有关［14］。Pagani 等［15］对意 大利南部医院引起下呼吸道感染的多重耐药性铜绿假单胞菌进行分析，发现多重耐药性铜 绿假单胞菌有金属 β内酰胺酶活性。这种金属酶基因(Integron)IMP13)，由Ⅰ类整合子和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合类整合子所携带，同 时Ⅰ类整合子和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合类整合子携带编码 AAC(Integron)6’CS)Ib 酶的 aacA4 氨基糖苷类基因盒。铜绿假单胞菌耐药机 制日趋复杂，是其耐药性常为多种机制并存。研究细菌整合子性质和种类，基因盒的种类 和表达，有利于对铜绿假单胞菌多重耐药性的发生和转移机制的了解。目前认为抗生素的 广泛应用和不合理应用，形成强选择性压力是铜绿假单胞菌多重耐药菌株出现的主要原因， 因此加强临床合理、有序应用抗生素，提高抗生素的有效性，同时减低抗生素的压力，削 弱整合子的发生从而减少铜绿假单胞菌多重耐药性菌株的产生。 ［摘要］目的：了解我院临床标本分离的支原体耐药性变迁，更好地指导临床合理用 药。方法：对 2004 年至 2006 年就诊的可疑非淋菌性阴道炎(Integron)NGU))患者进行支原体的培 养及药敏检测，并随机抽取 2004 年 369 例，2005 年和 2006 年各 500 例进行耐药变迁 分析。结果：交沙霉素(Integron)JOS)和原始霉素(Integron)PRI)3 年中的耐药率均<10%，喹诺酮类药物氧 氟沙星(Integron)OFL)和环丙沙星(Integron)CIP)的耐药率呈较高水平。大环内酯类药物 AZI 和 ERY 耐药率较 高，尤其在解脲脲原体(Integron)U)u)+人型支原体(Integron)Mh)混合感染中，喹诺酮类和大环内酯类的耐药 率均在持续高水平状态，TET 在混合感染中耐药率显著上升。结论：强力霉素 (Integron)DOT)、JOS 和 PRI 为治疗支原体的首选药物，但应定期监测支原体的耐药性变迁。 ［关键词］解脲脲原体；人型支原体；耐药性；监测 解脲脲原体(Integron)U)u)和人型支原体(Integron)Mh)是导致非淋菌性尿道炎(Integron)NGU))最常见病原体之一， 近年来其感染率上升很快，病原体耐药亦逐年增加。为了了解我院临床分离的支原体对常 用抗生素的耐药性变迁，我们对本院 2004 年至 2006 年 5 月分离的支原体进行药敏试验， 并随机抽取一部分进行耐药性变迁的分析，现将结果报告如下。 1 标本与方法 1.1 标本来源 2004 年至 2006 年 5 月来院门诊妇科患者，随机抽取 2004 年 369 例， 2005 年 500 例，2006 年 1 月至 6 月 500 例。 1.2 标本采集女性患者取宫颈分泌物：先用无菌棉签拭去宫颈口分泌物，然后用一次 性女用拭子伸入宫颈口 12cm～14cm 处停留 10s～20s，旋转 2 圈～3 圈，取出标本立 即送检。 1.3 试剂与方法支原体 IST2 试剂盒(Integron)法国生物梅里埃公司生产)；包被抗生素：强力 霉素(Integron)DOT)、交沙霉素(Integron)JOS)、氧氟沙星(Integron)OFL)、红霉素(Integron)ERY)、四环素(Integron)TET)、环丙沙星 (Integron)CIP)、阿奇霉素(Integron)AZI)、克拉霉素(Integron)CLA)、原始霉素(Integron)PRI)，严格按试剂说明书操作。 2 结果 2.1 支原体药敏试验结果 3 年中 U)u 单项感染 PRI 耐药率为＜0.5%，DOT、TET 均＜ 10%，CIP 耐药率最高，＞82.8%；U)u 和 Mh 混合感染中，2004 年组 PRI 为 0；2005 年 JOS、PRI 为 0；2006 年组 PRI 为 0。耐药率最高的是：2004 年 ERY(Integron)96.8%)、CIP(Integron)96.8%)，2005 年 CIP(Integron)93.3%)，2006 年 CIP(Integron)92.0%)。2004 年至 2006 年 U)u、U)u+Mh 耐药率见表 1 和表 2： 2.2U)u 耐药率的变迁 JOS、PRI、DOT3 年中耐药率最低(Integron)＜8%)，中敏率(Integron)＜5%)；大 环内酯类 ERY、AZI 的耐药率在 20%～30%之间；CLA2004 年 6.5%，到 2005 年至 2006 年分别高达 31.6%和 26.0%，喹诺酮类药物 OFL、CIP3 年的耐药率均处于最高水 平。 2.3U)u+Mh 混合感染耐药性变迁 PRI3 年中耐药率为 0，JOS 和 DOT 耐药率略有上 升，但小于 10%；TET 耐药率逐年上升，分别为 6.5%、15.0%、34.0%(Integron)P＜0.01)。大 环内酯类(Integron)ERY、AZI、CIA)耐药率呈逐年下降；喹诺酮类(Integron)OFL、CIP)3 年中均呈高耐水平。 3 讨论 支原体是一种缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过细菌滤菌器、在无生命培养基中能 生长的最小原核型微生物，U)u 和 Mh 主要寄生于人体泌尿生殖道，可引起急性尿道综合征、 NGU)、肾盂肾炎、阴道炎、盆腔炎、不育症、死产、早产及低出生体重儿、羊膜绒毛膜炎、 流产热和产后热［1］，有文献报道，U)u 是引起 NGU) 的重要病原体［2］，也是引起不孕 的重要原因［3］。由于支原体没有固定的细胞壁，因此对干扰细胞壁形成的 β内酰胺类 和头孢类天然耐药，而对抑制蛋白合成的抗生素敏感，如四环素类、大环内酯类 (Integron)ERY、AZI)和喹诺酮类 OFL、CIP 药物，TET 类抗生素能阻止氨酰基与核糖核酸结合，从 而阻碍肽链增长和蛋白质合成，对支原体有很好疗效。本文显示单项 U)u 感染者，TET 的 耐药率都在 10%以下，U)u+Mh 混合感染者，3 年中的耐药率显著上升，这可能与我院近 年使用该药物频繁有关。随着不规范的治疗和不合理使用抗生素，U)u 和 Mh 在抗生素的选 择压力下，通过某些基因如 DNA 促旋酶的突变，不断出现新的耐药株，而且不同地区使 用抗生素的频率不同，耐药率亦有所差异。结果显示，3 年中 U)u 单项感染患者中， DOT、JOS、TET、PRI 均维持在低耐药水平，喹诺酮类(Integron)OFL、CIP)和 ERY、AZI3 年耐药 率均持续在高水平，而阿奇霉素 3 年中耐药率呈明显上升。U)u+Mh 混合感染 3 年的耐药 率变化为：DOT、JOS、PRI 同 U)u 单项感染一致，维持在较低耐药水平，但喹诺酮类 OFL 和 CIP 的耐药率高达 70%以上，大环内酯类红霉素、阿奇霉素和克拉霉素也高达 64%～97%。原因可能与临床未能及时选用敏感药物及给药剂量不足、疗程不够，以致不 能彻底治愈，使不敏感药物，低浓度药物与支原体长期接触，诱导支原体耐药基因产生有 关［4］。随着抗生素的广泛应用，支原体耐药株日益增多，并出现了支原体多重耐药现 象，而支原体一旦出现耐药，就有可能是多重耐药菌株［5］，尤其是 U)u+Mh 混合感染 者。因此，对临床有症状患者应根据支原体培养结果，确定有否混合感染，再选择药物治 疗，避免滥用，以提高疗效和治愈率［6］。有文献报道，用多西环素和阿奇霉素同时服 用，总有效率达 96.8%,取得很好疗效［7］。总之，U)u+Mh 在不同时期，不同地区的耐 药性有很大差异，提示我们应对本地区的支原体耐药性定期进行监测，严防抗生素的滥用。 ［摘要］目的：合成(Integron)SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+(Integron)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+PVA(Integron)BCPDA)yEu3+Eu3+复合物，并用于构建妊娠 相关血浆蛋白 A 固相时间分辨免疫荧光试剂。方法：用 PVA 作为载体结合 BCPDAEu3+ 和生物素亲和素，以双抗体夹心法原理，结合生物素标记抗体和包被抗体建立 PAPPA 时 间分辨免疫荧光试剂，并进行方法学评价。结果：成功的合成了活性的 (Integron)SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+(Integron)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+PVA(Integron)BCPDA)yEu3+Eu3+复合物，构建 PAPPA 试剂检测灵敏度为 0.7mIU)/ L；批内变异系数在 3.89%～4.96%之间,批间变异系数在 7.35%～9.27%之间。结论： 合成的(Integron)SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+(Integron)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+PVA(Integron)BCPDA)yEu3+Eu3+复合物较高的反应活性，可以用于多种试剂的 构建。构建的 PAPPA 试剂灵敏度高，具有潜在的临床应用价值。 ［关键词］妊娠相关血浆蛋白 A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素—生物素—聚乙烯 胺—4,7 二氯磺苯基1，10 啡罗啉2，9 二羧酸—铕复合物；唐氏综合征 DevelopADirectSolidPhaseLanthaneTimeresolvedFluoroimmunoassayEu3+Rea gentofPAPPAutiliz(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ingPVA Abstract:ObjectiveTodevelopadirectsolidphaselanthanetime resolvedfluor oimmunoassayEu3+reagentofPAPPAbyEu3+syEu3+nthesiz(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ingacomplexPVA(BCPDA)yEu3+of(Integron)SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+(Integron)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+PVA(Integron)B CPDA)yEu3+Eu3+.MethodsPolyEu3+vinyEu3+lamine(Integron)PVA)waslabeledwithbiotin streptavidina ndeuropiumchelateof4,7bis(Integron)chlorosulfophenyEu3+l)1,10phenanthroline 2,9 dicar boxPVA(BCPDA)yEu3+yEu3+licacid(Integron)BCPDA).U)singlabeledPVAcomplexPVA(BCPDA)yEu3+,Wedesignedtwositesandwichti meresolvedfluoroimmunoassayEu3+ofPAPPAandevaluatedassayEu3+characteristicsofP APPAkit.ResultsWesuccessedsyEu3+nthesiz(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ingaconjuageteof(Integron)SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+(Integron)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+PVA (Integron)BCP DA)yEu3+Eu3+andareagentofPAPPA.Detectionlimitsachievedwere0.7mIU)/ L.Thecalibrationcurvewaslinear010000mIU)/ L.IntraandinterassayEu3+imprecision(Integron)CV)was3.89%4.96%and7.35%9.27%.Recov eryEu3+was95.8%104.2%.ConclusionsTheconjugateof(Integron)SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+(Integron)Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+PVA (Integron)BCPDA)yEu3+ E u3+syEu3+nthesiz(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+iedwasreactive,highlyEu3+fouorescent.AsortsofkitcouldbesyEu3+nthesiz(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ed ,takingadvantageofit.ThereagentofPAPPAwaspotentiallyEu3+suitedforuseinclinical withhighlyEu3+analyEu3+ticalsensitivityEu3+. KeyEu3+words:PregnancyEu3+associatedplasmaproteinA;ⅡDirectsolidphaselanthanet imeresolvedfluoroimmunoassayEu3+;ⅡStreptavidinbiotinPolyEu3+vinyEu3+lamineeuropium chelateof4,7bis(Integron)chlorosulfophenyEu3+l)1,10phenanthroline2,9dicarboxPVA(BCPDA)yEu3+yEu3+licacid;Ⅱ Down''''sSyEu3+ndrome 妊娠相关血浆蛋白 A(Integron)PregnancyEu3+associatedplasmaproteinA，PAPPA)是一种高 分子 α2 糖蛋白，20 世纪 70 年代在孕妇血清中被发现［1］。在孕妇血中主要 PAPPA 是 胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为 200000~250000 亚基构 成。PAPPA 亚基和两个嗜红细胞主要基础蛋白 (Integron)Proformofeosinophilmajorbasicprotein)以二硫键结合而成［2］，在孕妇血中只存在 微量游离单体 PAPPA。PAPPA 亚基由 1547 个多聚核苷酸构成，包括 1 个拉长的锌指结 构，3 个 Lin—notch 重复序列，以及 5 个短一致重复序列［3］。在体内 PAPPA 是一种 蛋白酶，主要针对胰岛素样生长因子结合蛋白 4(Integron)IGFBP4)和胰岛素样生长因子结合蛋白 5(Integron)IGFBP5)起作用。胰岛素样生长因子 I(Integron)IGFI)在促进细胞分裂和增殖起重要作用，它主 要通过 IGF1 受体起作用，IGFI、II 的生物活性受 6 个高亲和性 IDFBP 调节 ［4，5］。PAPPA 主要用于产前筛查唐氏综合征(Integron)Down''''sSyEu3+ndrome，DS)，迄今医 学上对此病尚无有效的治疗和预防措施，只能通过产前筛查防止 DS 儿的出生，但目前开 展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵入性检查,有 1%～3%的流产率,且方法繁琐, 出报告时间长,不适宜大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。大量报道认为 PAPPA 可作为 DS 胎儿产前筛查的的标志物。在 15 周～20 周通过结合孕妇孕周、超声诊断和 FreeβHCG 可以鉴别 65%～75%，但要在 3 个月～6 个月结合 AFP、游离 E3 以及抑制 素上述成分可鉴别 85%～90%［6］。有文献［7］报道 PAPPA 在急性冠状动脉综合征 (Integron)ACS)的早期诊断有一定的意义，PAPPA 在 ACS 患者血清含量＜30mIU)/L，同时结构不 同于孕妇体内的 PAPPA 且存在动态变化，必须利用超灵敏的方法进行检测。国内 PAPPA 的诊断试剂大多为 ELISA 和 PerkinElmer 公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫 分析(Integron)dissociatedenhancelanthanetimeresolvedfluoroimmunoassayEu3+,DELFIA) 试 剂，无国产 PAPPA 时间分辨荧光试剂。我们利用 PVA(Integron)聚乙烯胺)作为载体结合 BCPDA 镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫分析 (Integron)directsolidphaselanthanetimeresolvedfluoroimmunoassayEu3+,DSLFIA)试剂。为提 高检测灵敏度和克服 BCPDA 标记抗体使抗体失活的问题，我们引入了生物素亲和素 (Integron)biotinstreptavidinsyEu3+stem)系统。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 试剂 4,7 二氯磺苯基1，10 啡罗啉2，9 二羧酸 ［4,7bis(Integron)chlorosulfophenyEu3+l)1,10phenanthroline2,9dicarboxPVA(BCPDA)yEu3+yEu3+licacid,BCPDA 自制］；纯化亲和素(Integron)Streptavidin，SA，Sigma 公司)；硫代琥珀酰亚氨6 生物素氨基 己酯类 ［SulfosuccinimidyEu3+l6''''(Integron)biotinamido)6hexPVA(BCPDA)yEu3+anamidohexPVA(BCPDA)yEu3+anoate ，SulfoNHSLC LCBiotin，pierceChemicalCompanyEu3+］；聚乙烯胺氢氯化物