蛋白血症研究管理论文

【摘要】X-连锁无丙种球蛋白血症（X-linkedagammaglobulinemia，XLA）属于属于 原发性体液免疫缺陷病中的一种，又叫 Bruton 病。近年来，由于 Bruton 酪氨酸激酶 （Bruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinase，BTK）属于基因突变导致 B 细胞发育障 碍，所以不能产生免疫球蛋白。本文就近年来对 BTK 的遗传学特性、基因突变分析、分子 致病机制及诊断和治疗等的研究进展作一综述。 【关键词】X-连锁无丙种球蛋白血症（XLA）属于；Burton 酪氨酸激酶（BTK）属于；诊断； 治疗 【Abstract】Xlinkedagammaglobulinemia（XLA）属于belongstotheprimaryimmunodeficiencydis ease（PID）属于，whichcallsBrutondisease.Recently，itcannotgenerateimmuneglo bulin，becauseofthemutationoftheBruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinas e（BTK）属于gene，whichleadstodevelopmentaldisorderoftheBcell.Thisarticlerevie wsthegeneticcharacters，mutationanalysis，molecularpathogenicmechanisma ndtherapyoftheBKTgene. 【Keywords】XLA；BTK；diagnosis；therapy X 连锁无丙种球蛋白血症（X-linkedagammaglobulinemia，XLA）属于，又称 Bruton 无丙种球蛋白血症，是最早发现的人类原发性免疫缺陷病 （primaryimmunodeficiencydisease，PID）属于之一，Bruton（1952 年）属于首次报道。 患者临床上以反复细菌感染为特征，血清中各类免疫球蛋白明显降低或缺乏，对抗原刺激 不能产生抗体应答，血循环中 B 淋巴细胞减少，淋巴结及淋巴组织缺乏生发中心和淋巴滤 泡，骨髓中无浆细胞，但前 B 淋巴细胞数量正常，T 淋巴细胞数量及功能正常。典型病例 为出生后半年左右开始反复化脓感染（如肺炎链球菌或嗜血流感杆菌）属于或迟至幼年发病， 患者体内缺少成熟 B 细胞，基本上不能自主产生免疫球蛋白，必须依靠免疫替代疗法维持 体液免疫水平。该病严重危害患者健康，危及患者生命。80%～90%［1］临床诊断病例 可检出相关致病基因 BTK 发生突变，而其他 10%～20%［1］的病人存在其他问题，有 研究显示常染色体编码 Igφ［2，3］、μHCHC［4］和 LC 的基因存在突变。 1BTK 的遗传学特性大多数 PID 的遗传形式已经明确，几乎均为单基因遗传，多数为 常染色体隐性遗传，其次为 X 连锁隐性和常染色体显性遗传。大多数情况男性发病，女性 携带，但也有男性携带者不发病的报道。60%的 PID 突变基因的 DNA 序列已被克隆，突 变位点（包括突变基因定位的染色体节段和基因位点）属于和突变形式（单个核苷酸缺失、替 代、插入、移码突变、无义或错义突变等）属于也已确定［5］。在 WHOPID 专家委员会的指 导下，成立了有关疾病基因库，记录登记全球范围的 PID 基因突变及其类型。多基因遗传 性 PID 的确定较困难，至今尚无确切的报道。 1.1BTK 的蛋白结构 BTK 蛋白为 B 细胞信号传递系统中的重要蛋白，属于非受体型蛋 白酪氨酸激酶 Tec 家族的一员，该家族的成员还包括 TEC、ITK/TSK/EMT 和 BMX。Tec 家族蛋白酪氨酸激酶包括 5 个不同的结构区段（见图 1）属于，从 N 末端起为 PH（pleckstrinhomology；PH）属于段，约有 120 个氨基酸，TH（Techomology；TH）属于 段约有 60～80 个氨基酸 SH3（Srchomology3;SH3）属于段约有 60 个氨基酸，SH2 段约 100 个氨基酸，激酶催化段约 280 个氨基酸［6］。 图 1BTK 蛋白的组成（从 N 端开始）属于包括 5 个区域：PH、TH、SH3、SH2 和激酶区。 注：图上边的数字代表各段的氨基酸长度，图下边的数字代表不同的外显子及其相应 的位置。 BTK 蛋白的空间结构多数已测明，包括 PH 区、TH 区的前半部、SH3 区和激酶催化 区［7］，SH2 区的结构可借用其他蛋白激酶的类似结构进行研究。这些三维空间结构可 用于分析突变造成的蛋白空间结构的改变。 1.2BTK 基因的分子结构及其突变分析在 20 世纪 80 年代，多位学者应用 DNA 多态 性标志分析的方法，成功地将 XLA 的缺陷基因定位于 X 染色体中部（Xq21.3-22）属于的 2cm 区域内［8］。Vetrie 等用定位克隆方法在 XLA 病变基因区内分离鉴定了一个新的基 因，该基因表达于正常人各期 B 淋巴细胞，在 XLA 患者中发生突变，故认为是 XLA 的致 病基因。Tsukada 等也找到 XLA 的 KD 致病基因。BTK 基因全长 37.5kb，含有 19 个外 显子，除第一外显子外，其余 18 个编码 BTK 蛋白的 659 个氨基酸，分子量为 76KD［9］。cDNA 含有 2560 个核苷酸，有一个编码 659 个氨基酸多肽的开放阅读框架， 起始密码子在核苷酸第 133 位置上，在起始位置上游的 15 个密码子处阅读框架闭合。根 据国际研究小组 BTK 突变分析，迄今已经在 471 个家族 544 个 XLA 病人中发现了 BTK 基因 341 个独立存在的碱基置换、插入或缺失，其中有 13 个大段缺失和 2 个大段插入。 突变不仅存在于 19 个外显子，还涉及内含子和启动区域。其中，发生频率最高的是错义 突变，其次是无义突变和拼接位点突变。错义突变主要发生在三联体密码子的前两位。外 显子 8 和 9 的 185~287 位没有错义突变，这些位点可能不易突变或是功能上不重要。 33%的替代累及 CPG 双核苷酸，这是目前认为的最常见的突变热点［10］，而突变高频 位点 R520 也属于 CPG 突变［6］。编码外显子蛋白突变的区域［11］（见表 1）属于。表 1 编码外显子蛋白突变的区域 2BTK 的分子致病机制 BTK 属于非受体酪氨酸蛋白激酶，该类激酶广泛参与细胞信号 传导，影响细胞的存活、增殖和分化，BTK 是 B 细胞发育成熟的关键因素。正常人除 T 细 胞和浆细胞外均有 BTK 表达，而 BTK 基因突变只影响 B 细胞的数量，这说明 BTK 在 B 细 胞的生长发育过程中起着至关重要的作用。目前对 BTK 参与细胞信号传导研究比较清楚的 是 BCR 交联介导的信号传导途径。其过程简述如下：BCR 交联激活 Pl-3 激酶并产生一定 数量的 Pl-3，4，5-risphosphate 与膜结合，Pl-3，4，5-risphosphate 与 BTK 的 SH3 段作用使其定位于细胞膜。然后，BTK 经过两步活化：首先 BTK 激酶段 Y551 位磷酸化 （很可能是与 Lyn 作用）属于，接着是 SH3 段 Y223 位的自身磷酸化。活化后的 BTK 与 B 细 胞衔接蛋白（BLNK）属于结合并激活 phospholipaseC-γyy（PLC-γy）属于，导致钙离子通道打开， 胞外钙离子内流。该信号传导途径最终导致细胞增生加强和转录的变化。此模式仅限于以 B 细胞受体交联作为刺激信号，至于前 B 细胞受体交联是否也引起相同的信号传导目前还 缺乏证据［1，12］。该信号传导途径受 FcRⅡB 和 SHIP（SH2-containinginositol-5phosphatase）属于磷酸酶介导的另一途径制约，通过水解 Pl-3，4，5-risphosphate 和 Ins（1，3，4，5）属于-etraphosphate 关闭钙离子内流通道［13］。BTK 不仅可以由 BCR 和 FCR 介导激活，也可以通过其他很多受体激活，包括 G-proteincoupledreceptors（GPCR）属于、IL-3、IL-5 和 IL-6，另外，CD19 和单克隆抗体的交联也 可激活 BTK［13］，近年来研究表明，CD40 也是 B 细胞发育过程中的重要受体，传递刺 激信号影响细胞存活、生长和分化。与 BCR 介导的 BTK 活化途径相似，CD40 的交联也 可激活 BTK。CD40 和 BCR 可能是 B 细胞发育过程中不同阶段激活 BTK 的信号传递通路。 但也有研究提示 CD40 不通过 BTK 也可提高 NFKB 和 JNK 的水平，是独立于 BTK 的信号 传导通路［14～16］。BTK 在细胞内与很多分子相互作用，共同构成了一种微环境，在 信号传导的过程中起着重要的作用。这些分子分别与 BTK 的不同区段相互作用，其中与 PH 段作用的分子研究得很多，R28 附近区域与 PIP3、IP4、PKCβⅠⅠ、BP-135、F-actin、STAT3 和 Fas 作用。PH-TH 区域与 Gαqq 和 GβⅠ 双体作用;SH3 与 cCb1、WASp、Vav 和 sab 作用;SH2 与磷酸化的 BLNK 作用。另外，SH3 与 TH 在 BTK 分子内作用，抑制 BTK 的活性。在 BCR 交联介导的信号传导途径中，Syk 和 BLNK 对 BTK 的活化起正向调节作用，磷酸化的 PKCs、sab 和 IBTK 对 BTK 的活化有抑制作用。 尽管与 BTK 作用的分子很多，但是它们如何协调地与 BTK 作用，完成 BTK 参与的信号传 导，机制目前尚不清楚［17，18］。 3XLA 的诊断 XLA 是一种原发性体液免疫缺陷症，危害着人们的健康。因而，对该症 进行产前诊断和女性携带者的鉴定就显得十分重要［19］。为了研究 XLA 家系女性成员 的情况，Fearon 等采用了 X 染色体失活的方法去发现携带状况以及验证 B 淋巴细胞发育 的内在缺陷。根据这一方法用重组 DNA 探针同时发现 RFLP 和 X 染色体基因甲基化。在无 携带状态的女性的外周血粒细胞、T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞中发现 X 染色体的随机失活。 相反，该症的三个携带者在外周 B 淋巴细胞两个 X 染色体中的一个优先失活，但不是 T 细 胞或粒细胞。这一发现强烈地支持 XLA 是由 B 淋巴细胞发育的内在缺陷所致的假设。 Lovering（1994）属于等［20］对 BTK 基因缺失患者 DNA 分子斑点杂交分析见到了已改变 的 DNA 限制性片段，并对 7 个患者家庭用已经改变的限制性片段方法对与患者有关的女 性携带状况作出诊断。随后，Schuster 等［21］报道了对所有 19 个外显子。包括侧翼内 含子边界采用 PCR-SSCP 方法成功地检测到两例男性患儿 BTK 的 SH2 功能区的新突变， 并用一个已改变过的第一个引物做 PCR 扩增突变发生，作出三代中健康女性携带者的鉴定。 接着，Hagemann 等［22］对一个散发的 XLA 患儿及家庭的三代成员应用 PCR 扩增基 因组 DNA，采用序列分析的方法直接鉴定 XLA 的基因突变，结果诊断出患儿及其免疫学 表现正常的女性携带者。以上这些方法均可应用于产前诊断。这无疑对优生优育是很有意 义的。 4XLA 的治疗研究免疫重建是采用正常细胞或基因片段植入患儿体内，使之发挥功能， 以持久地纠正缺陷的基因及其表达产物。1968 年使用 HLA 配型同种异体骨髓移植治疗 2 例致死性免疫缺陷病获得成功。至今已有近 2000 例 PID 患儿接受骨髓移植，总存活率为 62%，其中同型合子骨髓移植达 79%。无关供体配型骨髓 （matchedunrelatedmarrowdonor，MUD）属于移植在近年已很盛行，成功率约为 50%，5 岁以内接受移植者可达 85%［23］。近年开展脐血干细胞移植，存活率为 75%。用母体骨髓 CD34+干细胞宫内移植（腹腔注射）属于已有成功的报道［5］。将正常 目的基因片段整合到患儿干细胞基因组内（基因转化）属于，随细胞有丝分裂，转化的基因片 段能在患儿体内复制而持续存在。理论上讲，凡能通过骨髓移植治愈的疾病均是基因治疗 的指针［24］。基因治疗 PID 的尝试已经历多年，取得一定成效，但尚处于探索和临床验 证阶段［25］。Faust 等［26］的动物实验是通过免疫球蛋白的增强子和驱动子介导的小 鼠 BTKcDNA 转录至两组免疫缺陷鼠（XLD 或 BTK-/-鼠）属于。转入 1 个拷贝的 XLD 或 BTK-/-鼠经蛋白印迹法检测其 BTK 达到正常量的 25%；而转录 2 个拷贝者其 BTK 达到正 常量的 50%。两组小鼠经检测均有正常数量的脾 B 细胞，两组小鼠对 TNP 一蔗聚糖刺激 所产生抗体的反应和血清 IgM、lgG3 水平较正常野生鼠明显减低，但较 XID 小鼠有所提 高。Drabek 等［27］通过人类 BTKcDNA 与鼠主要组织相容性复合体Ⅱ区调节因子的转区调节因子的转 基因治疗，纠正了 BTK 缺陷鼠的 B 细胞功能，并发现转入的基因并不表达于前 B 细胞以前 的分化阶段，此外它在胸腺上皮细胞、活化 T 细胞、单核细胞上表达，并在其他组织均有 低水平表达。经蛋白印迹法检测转基因鼠的脾细胞产物发现，BTK 蛋白总含量可达到与野 生型鼠相同。这些研究均向我们提供了基因治疗 XLA 的可能性。此外，Rohrer 等［28］ 通过动物实验证实，应用极少量正常骨髓细胞输注即可通过竞争使 XID 小鼠获得 B 系统免 疫重建。这项研究推测，即使不成功的基因治疗也可对 XLA 患者有益，为今后开展人类 XLA 的基因、细胞治疗提供有利的基础和广阔的前景。总体上说，尽管目前基因治疗离成 熟的临床治疗技术还有相当的距离，但经过近 10 年的临床试验，人们已获得了大量宝贵 的临床资料。我们有理由相信，XLA 的基因治疗将在不久的将来获得突破性进展。 5 展望尽管 80%～90%临床诊断为 XLA 的病人依靠 BTK 突变检测确诊为 XLA，但是 XLA 的基因突变位点很多，与临床症状的相关性不强，同一家系中的 XLA 病人临床表现程 度很可能各不相同。即：基因型和临床表型的关系是目前需要研究的课题之一［29］。这 涉及到突变基因产物蛋白质的功能、结构稳定性和二维构像［30，31］。这样，通过基因 突变及其对蛋白的影响无法预知 XLA 的病程、复杂程度、B 细胞数量和免疫球蛋白的水平。 只有彻底明确 BTK 在 B 细胞信号传导中的作用机制，才能找到基因突变和临床症状的相关 性，完善 XLA 的基因诊断，并为治疗奠定理论基础［32］。1994 年，国际上成立了 BTK 基因突变分析小组并建立了 BTK 基因突变数据库（http：http://www.uta.fi/imt/ bioinfo/btkbase/）属于，为 XLA 的基因诊断提供了便利的条件。但是数据库中的病源主要来 自西方国家、日本和俄罗斯，而国内的 BTK 基因研究相对处于空白阶段。因此，目前开展 BTK 基因突变的检测工作应成为国内同类研究的重点，通过建立有效可靠的 BTK 基因突变 筛查方法，研究中国人 BTK 基因突变的规律。因此，随着对 PID 认识的深入和检测方法的 简化，将会有更多的病例被确诊，不仅可以用常规方法治疗，而且可以做基因分析，同时， 建立 PID 登记网络［33］，也将有助于了解确切的发病率和需要治疗的患者。总之，来自 突变基因的 BTK 蛋白还没有被完全认识，在蛋白质水平这些突变的结果还不清楚。BTK 基 因突变在 XLA 发病机制中更详细作用还不清楚，但作为疾病基因，对其基因组结构的研究， 将为未来的体细胞基因治疗创造条件。当然，体细胞治疗存在着一定的问题，目前还不能 达到此目的，但这是今后研究的一个重要方向，基因治疗无疑是近 20 年来分子生物学和 重组 DNA 技术迅速发展的一种结果。由于体内大剂量静脉丙种球蛋白的长期替代疗法有 不少的副作用，且价格昂贵，不能根本解决问题。若能将缺陷的基因进行原位的修补，基 因治疗将是最理想的根治方法。 【摘要】目的观察奈韦拉平用于艾滋病母婴阻断治疗效果。方法单用奈韦拉平进行艾 滋病母婴阻断。用法：母亲在产前 2h 服用奈韦拉平 200mg，婴儿出生后，服用奈韦拉平 6mg，如果母亲在服药后 2h 内分娩者，婴儿出生后服奈韦拉平 6mg 两次。结果通过 118 例临床观察，满 18 个月随访检测 77 例，75 例全程检测为阴性，2 例阳性，母婴阻 断成功率 97.4%。结论通过自愿咨询、检测、阻断、临床观察证明奈韦拉平用于母婴阻断， 临床效果好、价廉、服用方便、安全可靠、无毒副作用、不影响婴幼儿生长发育。 【关键词】奈韦拉平；艾滋病；母婴阻断 【Abstract】ObjectiveToobservethenevirapineclinicalcurativeeffectofAIDS blockbetweenmotherandinfant.MethodsUsingnevirapinetoblockAIDSpropagati onbetweenmotherandbaby.Mothershouldtakenevirapine200mgbeforeparturiti on;thenbabytookthenevirapine6mg;Ifthemothergiveabirthwithintwohoursaftert akingmedicine,herbabyshouldtakenevirapine6mgtwice.ResultsThrough118cas esclinicalobservation,followingup77casesbyregularvisitsafter18months,75case smeasuredarenegativeinthewholecourse,2arepositive,therateofblockbetween motherandbabyis97.4%.ConclusionTheclinicalobservationprovethatnevirapinei scheap,convenience，safe,reliable,nosideeffectinAIDSblockbetweenmotheran dinfant. 【Keywords】nevirapine;AIDS;AIDSblockbetweenmotherandinfant 奈韦拉平（维乐命）属于是一种治疗 HIV-1 型成人和儿童感染的联合抗逆转录病毒疗法的 一个组分。其阻断 HIV 复制的方式与核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)NRTI)或蛋白酶抑制剂（PI）属于 不同，主要通过与逆转录酶的紧密结合，从而阻止病毒 RNA 转化为 DNA。Atlantic 研究 显示：含奈韦拉平的疗法对有高基础血浆病毒载量且既往未接受过抗逆转录病毒药物治疗 的患者是有效的。 采用奈韦拉平疗法治疗的患者中，发挥更持久的抑制病毒作用，有 62%的患者治疗 持续有效（血浆病毒载量:20 拷贝数/ml)达 2.75～3.5 年。与短期 ZAT 疗法相比，简单的 奈韦拉平疗法可导致 HIV-1 的母婴传播率减少 47%，它与同一个更复杂、更昂贵的 AZT/ 3TC 疗法在降低围产期 HIV-1 的母婴传播上是一样有效的。奈韦拉平对分娩时未使用抗逆 转录病毒治疗的孕妇，单独应用奈韦拉平能有效预防 HIV-1 的母婴传播，成为耐药性更好 而疗效更佳的治疗方案。 上蔡县是一个人口密集、经济文化落后的大县，因 1993～1996 年有偿献血，引起 了艾滋病的大传播，文楼村成了闻名世界艾滋村，引起了联合国儿基会的重视。于 2004 年 10 月在我县应用奈韦拉平进行母婴阻断项目工作，经过 4 年的治疗观察，治疗上取得 了很好的疗效。现报道如下。 1 临床资料 我县自 2001 年 10 月～2006 年 9 月以来，共收治艾滋病产妇 118 例，年龄最小 24 岁，最大 38 岁，平均 30 岁。自然分娩 99 例，剖宫产 19 例。0 检测阴性:0 例，阳 性:118 例；9～12 个月检测 92 例，阴性:46 例，阳性:42 例,死亡 4 例；满 18 个月检测 77 例，阴性:75 例，阳性:2 例，阻断成功率：97.4%。18 个月检测均由省防疫站确认检 测，阻断情况参照表 1。 表 1 母婴阻断统计（略）属于 在 118 例病例中抽出 36 例经产妇，第一胎婴儿 HIV 检测结果对照比较，见表 2。 表 2 未进行母婴阻断统计（略）属于 经过以上表中的比较，进行药物阻断和未进行药物阻断相比，阴性率提高了 31%。 证明奈伟拉平进行母婴阻断效果好，值得推广应用。 2 讨论［1～7］ 艾滋病称获得性免疫缺陷综合征(NRTI)Acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS), 是由艾滋病病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV,免疫缺陷病毒）属于感染的性传播疾 病。其主要特点是艾滋病病毒感染后造成人类细胞免疫功能严重缺陷，使人的抵抗力逐渐 下降。艾滋病病毒感染初期没有任何特殊症状。当艾滋病病毒感染者的抵抗力遭到艾滋病 病毒严重破坏后，不能维持最低的抗病能力时，便造成多系统、多器官发病、感染和恶性 肿瘤等，这时就称为艾滋病病人。艾滋病主要致病病毒分为 HIV-1 型和 HIV-2 型，HIV-1 型是主要病原。