金莲花牡荆苷药学综述

金莲花是毛茛科植物金莲花 TrolliuschinensisBunge 的干燥花及花蕾，主要有效成 分为黄酮类化合物［1］，所含有效成分单体有牡荆苷、荭草苷、槲皮素等。现代药理研 究发现牡荆苷具有较强的体外抗氧化活性［2］，中等强度的抗病毒活性［3］，对缺血性 心肌损伤具有良好的保护作用，其作用机制可能与增加冠脉和心肌血流量、降低血管射血 阻力、降低全血及血浆黏度、提高红细胞变形能力、抑制血栓形成等有关［4-8］。牡荆 苷作为从中药中提取分离的有效成分，有必要在临床前对其活性、安全性和药动学进行全 面的评价。金莲花中牡荆苷以不同给药方式在兔体内药动学研究及在兔体内组织分布研究 尚未见报道。本实验采取静脉、腹腔、肌肉注射 3 种不同给药方式阐明牡荆苷在新西兰白 兔药动学过程及静脉注射后牡荆苷在兔体内组织分布情况，为牡荆苷在临床上的合理用药 提供理论依据。 1 材料与仪器 美国 Agilent1100HPLC(配四元泵、紫外检测器);日本 GR-202 型 AND 分析天 平;Sigma 公司高速冷冻离心机;北方同正生物技术发展公司 HQ-60 型旋涡混合器。野生 金莲花采自河北省张家口沽源，经我院药物研究所马淑兰教授鉴定为金莲花 TrolliuschinensisBunge;牡荆苷标准品(111687)，中国药品生物制品检定所;牡荆苷单 体(纯度 98.8%，河北北方学院实验中心自制);液相色谱用有机溶剂为色谱纯，所用水为三 重蒸馏水。其它试剂为分析纯。新西兰白兔，雌雄各半，体质量(2.5±0.3)kg，由河北北 方学院动物中心提供，室温饲养 1 周，实验前禁食 12h，自由饮水。 2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为 HypersilBDS-C18(4.6mm×150mm，5μm);m);流动相为 1% 乙晴-乙酸(85∶15);检测波长为 340nm;柱温 30℃，体积流量 1mL/min;进样量 20μm);L。 2.2 血样及组织样本处理取新西兰白兔 18 只，禁食 12h，自由饮水，随机分为 3 组， 每组 6 只，20%氨基甲酸乙酯静脉麻醉(5mL/kg)，颈总动脉插管，以 20mg/kg 的剂量 分别静脉、腹腔、肌肉注射， 0、2.5、5、7.5、10、15、20、25、30、45、60、90、120、180、240、300min ，取血 0.3mL，11000r/min 离心 10min，取上清液 0.1mL，加乙腈沉淀蛋白，涡流混 旋 1min，离心，取上清液，微孔滤膜过滤即得。取健康新西兰白兔 60 只，按体质量随机 分为 12 组，给药前禁食 12h，自由饮水。静脉注射 20mg/kg，分别于 5、10、15、30、45、60、75、90、120、180、240、300min 放血处死动物，立即 解剖取出肾、肝、肺、脾、心、脑组织，用生理盐水清洗各组织表面浮血，滤纸吸干，精 密称定质量，剪碎，加生理盐水在冰浴中制成 50%匀浆，取各组织匀浆 0.1mL，加乙腈 0.2mL 沉淀蛋白，旋涡混匀 1min，11000r/min 离心 10min，取上清液微孔滤膜过滤即 得。 2.3 数据处理采用 3P97 药动学软件对不同给药方式血药浓度-时间数据进行拟合，以 理论血药浓度值与实验测定值的相关系数最大和 AIC 值最小作为判断标准，选择适当的房 室模型，计算药动学参数。所有数据均用珋 x±s 表示，用 SPSS16.0 统计学软件做方差分 析。 2.4 方法专属性考察按 2.1 项下牡荆苷峰分离良好，血浆、各组织中杂质及内源性物 质均不干扰，且灵敏度高，样品中牡荆苷的理论塔板数均大于 5000，保留时间为 6.96min，与相邻色谱峰的分离度均大于 3。 2.5 标准曲线制作新西兰白兔空白血浆、组织中加入系列质量浓度牡荆苷对照品溶液 进样后，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，经线性回归得牡荆苷在血 浆、各组织中的标准曲线。见表 1。 2.6 精密度与稳定性高、中、低(6.18，3.08，0.154μm);g/mL)3 种不同质量浓度样品 的日内精密度 RSD 分别为 0.74%、1.32%、3.51%，日间精密度 RSD 分别为 0.84%、1.64%、3.63%，样品溶液分别放置 0、2、4、6、8、10、12、24h 后，牡 荆苷峰面积的 RSD＜3.2%，表明样品在 24h 内较稳定。 2.7 回收率试验高、中、低(6.18，3.08，0.154μm);g/mL)3 种不同质量浓度样品， HPLC 测定药物浓度，血浆以及各组织加样回收率均大于 75%，见表 2。 2.8 药-时曲线及药动学参数新西兰白兔静脉注射的药-时曲线见图 2;腹腔、肌肉注射 的药-时曲线见图 3，不同给药方式所得药时数据经 3P97 拟合，利用 F 检验进行方差分析， 主要药代动力学参数见表 3。新西兰白兔静脉注射 20mg/kg 后，采用统计矩理论计算了 各个组织的 AUC，各组织的 AUC 顺序为肾＞肝＞肺＞脾＞心＞脑，说明牡荆苷在兔体内 各组织广泛分布。将各组织 AUC 进行对数转换后，依次进行正态性检验、方差齐性检验和 方差分析，结果显示，不同组织的 AUC 有显著性差异(P＜0.05)。见表 4。 3 讨论 新西兰白兔静脉注射其 t1/2 为 5.052min，分布速率常数 a 为 0.139min－1，说明 牡荆苷在兔体内分布较快，药物起效迅速。t1/2β 为 114.291min，血浆中牡荆苷的消除 速率常数 β 为 6.177×10－3min－1，t1/2β 远大于 t1/2α，说明牡荆苷在兔体内主要以 消除过程为主。本实验结果表明静脉给予牡荆苷后其在新西兰白兔体内符合二房室模型药 动学特征。这与李德强［9］报道的荭草苷在大鼠体内符合三房室模型不同，这可能与所 用动物种属不同有关。3 种不同给药方式在新西兰白兔体内均符合二房室开放模型，并且 消除相较短，表明牡荆苷在新西兰白兔体内很快消除，不易蓄积中毒。 近年来，随着对山香圆属研究的深入，其药学价值也受到了更多关注。山香圆属 (TurpiniaVent．)植物属于省沽油科，约 30 种，分布于亚洲和美洲的热带地区，我国约 有 13 种，分别为心叶山香圆(T．subsessilifoliaC．Y．Wu)、锐尖山香圆 (T．arguta(lindl．)Seem、台湾山香圆(T．formosanaNakai)、亮叶山香圆 (T．simplicifoliaMerr)、疏脉山香圆(T．indochinen-sisMerr)、硬毛山香圆 (T．affinisMerr．etPerry)、三叶山香圆(T．ternataNakai)、大果山香圆 (T．pomifera(Roxb)DC、卵叶山香圆(T．ovalifoliaElmer)、大籽山香圆 (T．macrospermaC．C．Huang)、粗壮山香圆(T．robustaCraib)、山香圆 (T．montana(BL)Kurz))和越南山香圆(T．cochinchinensis(Lour)Merr);主产于我国西 南部至台湾［1］。 1 成分研究 1．1 黄酮类 章光文从山香圆叶中分离得到 4 个黄酮类化合物，分别鉴定为金丝桃苷、槲皮素－3 －O－洋槐糖苷、野漆树苷和女贞苷［2］。赖闻玲选用山香圆为材料，使用常规回流法、 微波法和超声法提取其中的黄酮，用分光光度法对其黄酮含量进行了测定，发现黄酮类成 分是山香圆的主要成分［3］。罗宪堂从山香圆口服液中提取出黄酮，并利用紫外可见分 光光度计测定山香圆口服液中黄酮类成分含量［4］。 1．2 熊果酸类 朱建华采用高效液相色谱测定了山香圆中熊果酸的含量。郑佳嘉使用双波长薄层扫描 仪测定了山香圆片的熊果酸的含量［5］。毛友昌以山香圆叶为材料，以熊果酸标准品为 对照，应用薄层扫描法成功测定山香圆中的熊果酸成分［6］。魏福有采用薄层色谱法对 山香圆叶和山香圆含片中熊果酸含量进行定量分析［7］。 1．3 齐墩果酸、对香豆酸、肉豆蔻类 方乍浦通过对山香圆叶中物质成分进行提取和测定，发现其叶中含有齐墩果酸、对香 豆酸和肉豆蔻类成分，这些物质均具有生物活性［8－10］。 1．4 苷类 章光文从山香圆中提取出了女贞苷和野漆树苷，采用反相高效液相色谱法同时测定山 香圆片中女贞苷和野漆树苷的含量［2］。ChemphannBull 从省沽油科植物三叶山香圆 叶中分离出多种苷类，并分别命名为山香圆苷 A、山香圆苷 B、山香圆苷 C 和山香圆苷 D 等。 1．5 酚酸类成分 李云秋综合运用多种现代分离方法和技术，从锐尖山香圆叶的水提取物中分离得到 5 个酚酸类化合物，综合运用现代波谱技术分析其结构，分别鉴定为香草酸、对羟基肉桂酸、 焦没食子酸、没食子酸、2－4’－羟基－苄基－2－羟基－丁二酸、α－呋喃甲酸和丁二酸 酐;上述化合物全部为在该科中首次发现［11］。Matthew 从三叶山香圆的茎中提取出了 鞣花酸以及其衍生物成分［12］。 1．6 生物碱类 WuMin 从锐尖山香圆中发现了生物碱类成分，其中包括 turpiniside 和 11－ methoxyjavaniside 两种新成分［13］。 1．7megastigmane 类化合物 Yu，Q 从山香圆的叶中分离出了 megastigmane 类化合物［14］。 2 药理研究 2．1 抗炎作用 许哲洪比较发现，山香圆颗粒治疗上呼吸道感染的疗效较好［15］。Zhang，L 通过 向患有关节炎的大鼠注射山香圆提取液成分，发现有很好的抑制作用［16］。郑标通过试 验发现，山香圆片治疗急性咽部炎症疗效较好，尤其以重度患者疗效更好［17］。楼正才 通过观察中药山香圆片治疗急性单纯咽炎的疗效，发现该药具有良好的抗炎、抑菌和化痰 作用，且安全可靠［18］。张磊采用二甲苯诱导的小鼠耳肿胀、角叉菜胶诱导的大鼠足爪 肿胀、棉球诱导的大鼠肉芽肿和福氏完全佐剂诱导的大鼠佐剂性关节炎模型，研究了山香 圆总黄酮(TFS)的抗炎作用，发现其对大鼠佐剂性关节炎具有抑制作用［19］。周嵘通过 对山香圆片治疗急性扁桃体炎 80 例疗效观察，发现疗效较好［20］。周秦秦应用随机对 照的方法评价了中药山香圆含片治疗急性咽炎患者 30 例的疗效和安全性。结果表明，其 总有效率和显效率分别为 86．7%和 60．0%［21］。 2．2 抗菌作用 詹怡飞通过对山香圆片的抑菌试验，观察灌胃给药山香圆片小鼠体内感染金黄色葡萄 球菌后死亡率，发现山香圆含片对小鼠腹腔感染金黄色葡萄球菌有较好的保护作用，提示 该药具有抗菌作用［22］。杨义方体外抑菌试验结果表明，山香圆对金黄色葡萄球菌有较 强的抑菌作用［23］。 2．3 镇痛作用和调节免疫作用 张磊通过观察山香圆总黄酮体外对佐剂性关节炎大鼠免疫功能的影响，发现山香圆总 黄酮对大鼠的异常免疫功能具有调节作用［24］。金涌发现 TFS 能明显改善 cy 致免疫功 能低下小鼠的免疫功能，其免疫调节作用与调节 T 细胞亚群有关［25］。詹怡飞通过试验 研究发现，山香圆含片能明显降低醋酸所致小鼠扭体反应次数，提高热板所致小鼠痛阈， 对二甲苯所致小鼠耳肿胀、蛋清性大鼠足趾肿胀所致小鼠腹腔毛细血管通透性提高均具明 显的抑制作用，表明山香圆片具有镇痛作用［26］。 3 临床应用 黄倬英考查发现江西安远县民间用山香圆的叶来治疗咽喉炎等疾病，效果明显 ［27］。杨国泉研究发现，山香圆属植物具有较好的抗菌消炎作用，其主要成分为山香圆 叶，临床用于治疗扁桃体炎、咽喉炎和扁桃体脓肿［28］。传统的方剂有:① 治泄泻、痢 疾:山香圆一至二两，水煎服。②治妇女血崩:山香圆四两，桂圆一两，水煎服。③治外伤 肿痛:鲜山香圆和酒捣烂，烘热敷患处。④治产褥热:山香圆、白英各三钱，梵天花五钱， 羊耳菊、蛇莓各二钱。用酒、水各半煎，加红糖一两冲服。⑤治风湿腰痛，产后伤风:山香 圆一至三两。水煎调酒服。⑥治偏头痛:山香圆、鸡儿肠、金银花根、单叶铁线莲各五钱， 黄酒煎服。⑦治关节或肌肉风痛:山香圆三两，煎服。⑧治跌打损伤、筋骨痛:山香圆五钱， 水煎服。 3．1 治疗炎症刘立生通过观察山香圆片对扁桃体炎的治疗疗效，发现山香圆片能很好 地治疗急性扁桃体炎(急乳蛾)、咽炎等口腔和咽喉疾病。曾国华发现山香圆片能很好的治 疗咽炎。 3．2 清热解毒，消肿止痛据全国中草药汇编记载，山香圆具有清热解毒和消肿止痛的 临床功效。詹怡飞研究发现，山香圆片能有效抑制炎症如咽喉炎和扁桃体炎产生的疼痛 ［24］。 3．3 毒蛇咬伤据中国科学植物研究所的研究发现，山香圆植物在治疗毒蛇咬伤具较好 疗效。 4 制剂工艺研究 为了控制山香圆片的质量，常采用现代分析仪器来检测其有效成分的含量。章光文采 用反相高效液相色谱法同时测定山香圆片中女贞苷和野漆树苷的含量，该法简便、准确， 重复性好，可为山香圆片的质量控制提供试验依据［13］。罗宪堂运用紫外－可见分光法 (UV 法)以对照品芦丁的黄酮类含量，测定山香圆叶中黄酮类成分含量［29］。罗宪堂研 究了山香圆含片的最佳制备工艺［30］。罗四莲设计了对山香圆植物的总油脂提取工艺 ［31］。 5 小结与展望 通过对相关文献的查阅发现，目前对山香圆抗菌抗炎方面的研究比较透彻，临床用药 效果良好，但在治泄泻、痢疾，偏头痛和毒蛇咬伤方面还需深入研究其机理，尤其在分子 水平上对山香圆属植物的作用机制研究几乎处于空白阶段，为此需要加强相关研究，以更 深入地发掘山香圆属植物的药学价值。 他克莫司(tacrolimus,FK506)是一种新型强效免疫抑制剂,是链霉菌属中分离出来的 发酵产物,常温下呈白色结晶状粉末,分子式为 CH60N2HO,分子量为 822.05[1]。由于对 T 细胞有选择抑制作用,主要用于抗器官排斥性疾病肝、肾移植的急性排斥反应或是免疫性 疾病类风湿性关节炎、红斑狼疮等疾病,药物本身和其代谢产物都具有一定的毒性,所以进 行血药浓度监测是其使用的一个必备前提。目前监控其血药浓度的方法有许多,但是高效液 相色谱法尚未成体系。本文采用反相高效液相色谱法测定他克莫司血药浓度[2],方法准确、 可靠、简单,适用于临床上监测他克莫司的血药浓度的广泛推广。2011 年 2 月～2011 年 6 月,我们研究了使用反相高效液相色谱法测定他克莫司血药浓度的可行性。 1 材料与方法 1.1 材料 仪器与药品仪器:3200Qtrap 型液相色谱一串联质谱仪;药品:他克莫司胶囊(规格为 1mg/粒,浙江海正药业股份有限公司,批号:20100412);他克莫司对照品(上海同田生物技 术有限公司批号:084120L);乙腈为色谱纯,其它试剂为分析纯。 1.2 方法 1.2.1 色谱条件:色谱柱:DiamonsilC18 柱(250mm×4.6mm×5μm);m);流动相:乙 腈:0.2%磷酸:四氢呋喃(55:40:5);流速:1.2ml/min;柱温:30℃;进样量:20。 1.2.2 样品溶液的配制:精密称取他克莫司 10mg,全部转移至 100ml 容量瓶中,加入乙 腈至刻度摇匀,制成 0.1mg/ml 的溶液,放入冰箱保存。 1.2.3 标准溶液的配制:精密称取他克莫司对照品 10mg,全部转移至 l00ml 容量瓶中, 加入乙腈至刻度,摇匀,即得浓度为 0.1mg/ml 的标准品对照液。分别取标准品 2、4、6、8、10ml,用乙晴稀释至 20ml,做成标准曲线。 1.2.4 全血样品处理:取血清 0.5ml,加入 5ml 乙醚,振荡 3min,3000r/min 离心机处理 10min,将上清液转移至另一管中,留待进样。 1.2.5 配制好的液体每次进样 20μm);l,每一浓度进样三次,如结果无太大偏差,取其平均值。 以峰面积(A)对浓度(C)进行回归,他克莫司的浓度在 1.32~16.0μm);g/ml 范围内线性关系良 好。 2 结果 2.1 回收率