小议铜绿假单胞菌整合子与多重抗药性探索

摘要目的在铜绿假单胞菌中检测 1 类整合子并分析整合子对细菌耐药性的影响。方法 用 VITEK-AMS 微生物自动分析仪鉴定细菌和药敏试验，用 PCR 方法扩增 I 类整合酶基因， 经电泳后检测扩增产物。结果 158 株铜绿假单胞菌中检测出 1 类整合子 42 株，检出率为 26.6%。1 类整合子阳性菌对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物表现出较高的耐药 率。携带 1 类整合子菌株易表现出对至少 4 种抗菌素的多重耐药性，其多重耐药率为 68.6%(33/48)，明显高于 1 类整合子阴性菌株（28.6%），P＜0.05。结论 1 类整合子 广泛存在铜绿假单胞菌中,1 类整合子对细菌多重耐药性的产生和传播起着重要作用，应加 强临床细菌基因水平的耐药监测，采取有效措施防止耐药性的传播。 关键词铜绿假单胞菌整合子多重耐药 铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液 病和恶性肿瘤的患者以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。本菌引起的感染病灶可导 致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。随着抗 生素的广泛使用和不合理使用，使包括铜绿假单胞菌在内的多种细菌的耐药性问题日益严 重。 整合子是与细菌耐药性传播有关的基因系统，整合子通过捕捉和整合细菌耐药基因， 在细菌耐药性的传播和扩散中起了重要的作用。整合子通过位点特异性的基因重组可整合 多种耐药基因对细菌多重耐药的形成起着重要作用。 本文对 158 株铜绿假单胞菌进行分析，以探讨铜绿假单胞菌整合子与其多重耐药性之 间的关系。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源 2009 年 10 月～2010 年 5 月从我院临床标本中分离的铜绿假单胞菌 158 株。标本分 别来自老年病房(53 株)、呼吸科病房（49 株）、普外科病房(28 株)、泌尿科病房(16 株) 和内分泌病房(12 株)。菌株分别分离自痰标本（68 株）、脓汁(42 株)、咽拭子(18 株)、 尿标本(12 株)、伤口分泌物（10 株）和血液（8 株）。标准质控菌株为铜绿假单胞菌 （ATCC27853）。携带 1 型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为 PCR 实验阳性对照。 1.1.2 鉴定卡片 全自动微生物分析仪(VITEK-AMS)采用的 GNI 鉴定卡、GNS 药敏卡均购自法国 Biomerievx 公司,GNS 药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维 酸、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、头孢噻肟、亚胺 培南 11 种抗菌药物职称论文。 1.1.3PCR 试剂 TaqDNA 聚合酶,4 种 dNTP 混合液,DNA 分子标准参照物购自 Takara 公司;琼脂糖, 溴化乙啶等常用分子生物学试剂购自上海生工公司。 1.1.4 主要仪器 VITEK-AMS 自动鉴定系统购自法国 Biomerievx 公司;PCR 扩增仪、DNA/RNA/ proteinanalyzer 分析仪和高速低温离心机购自德国 eppendorf 公司;PCR 电泳仪为北京 崇文东方仪器厂产品;DGW-99 型台式高速微型离心机为宁波新芝科器研究所产品。 1.2 实验方法 1.2.1 菌株鉴定 所有菌株都用 VITEKAMS 分析仪 GNI 细菌鉴定卡进行菌种鉴定。体外药物敏感试验： 采用 GNS 检测卡测定 13 种抗菌药物对 158 株铜绿假单胞菌的 MIC 值，操作方法按照 VITEKAMS 规定的方法进行。 1.2.2 加热裂解法制备 DNA 模板 :用 Luria-Bertani 液体培养基 200r/min 振荡培养 8h 获得对数生长期菌株。携带 1 型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为 PCR 实验阳性对照。 1.2.3 筛选 1 型整合子阳性菌株 用 PCR 方法扩增整合子可变区，以整合子上游引物 ggcatccaagcagcaagc 和整合子 可变区下游引物 aagcagacttgacctgat，进行 PCR 扩增。50ulPCR 反应体系 为:DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L 引物和 2.5UTaq 酶。 PCR 反应循环参数设置如下 94℃预变性 4 分钟；94℃45 秒，55℃，45 秒，72℃3 分 钟，循环 35 次；最后 72℃延伸 10 分钟。 1.2.4PCR 反应结束后取产物琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照记录结果。 1.2.5 统计学处理 采用 χ2 检验，P＜0.05 有显著差异。统计软件为 SPSS10.0。 2 结果 2.11 类整合子基因检测结果 全部 158 株铜绿假单胞菌的 DNA 上有 42 株检测到 I 类整合子，占细菌总数的 26.6%。1 类整合子的大小分别为 600bp、1000bp、1600bp、1900bp 和 2100bp。 根据各株细菌质粒 DNA 上检测到 1 类整合子的大小和数目，细菌质粒 NDA 上的整合子可 分为 5 种整合子谱。 2.21 类整合子阳性菌株与耐药性的关系 对比 1 类整合子阳性菌株与阴性菌株对抗菌药物的耐药率，并做统计分析，结果见表 1。 1 类整合子阴性菌株对 11 种抗菌药物完全敏感率为 54.4%（86/158）。1 类整合子 阳性菌株更易表现出对青霉素、喹诺酮类、磺胺类药物的耐药。耐药率最高的是复方新诺 明（100%）其次为氨苄青霉素（90.5%）和庆大霉素（85.7%），丁胺卡那也表现出较 高的耐药率（76.7%）。1 类整合子阳性菌株对 6 种药物的耐药率显著高于阴性菌株， P<0.05。 2.31 类整合子与多重耐药率的相关性 多重耐药率(耐 4 种以上抗生素)为 62.0%(98/158)，其中 1 类整合子阳性菌株多重耐 药率占 85.7%(36/42)，阴性菌株多重耐药率为 20.7%(24/116)。1 类整合子阳性菌株 多重耐药率明显高于阴性株，差异有统计学意义(χ2=18.23，P<0.01)。 3 讨论 整合子是存在于细菌质粒、染色体或转座子上的一种遗传结构，可以捕获耐药基因， 使细菌表现为对抗生素的多重耐药[1]给临床治疗带来极大的困难。整合子本身不能移动， 但常作为转座子的一部分或借助可移动性质粒在同种细菌或不同种细菌间播散，造成细菌 耐药性的扩大，是细菌多重耐药迅速发展的重要原因。根据整合酶的不同分为 6 类[2]在临 床分离的菌株中以 1 类合子最为常见。1 类整合子基本结构由三部分组成,两端为高度保守 的序列，分别称作 5’CSCS 和 3’CSCS,5’CSCS 和 3’CSCS 之间为可变区，可变区由一个或多个外来 插入的基因盒组成[3]。在整合酶的催化下．通过位点重组系统整合外来耐药基因，使耐药 基因得到不断的累积，从而使细菌具有耐药性和多重耐药性。目前在 1 类整合子中发现的 基因盒已超过 80 种，大部分是耐药基因盒，编码产物可赋予细菌对几乎全部临床抗生素 耐药。 铜绿假单胞菌作为医院感染的重要的条件致病菌，在长期应用激素、免疫抑制剂，进 行肿瘤化疗、放射治疗等导致病人免疫功能低下，以及手术后或某些治疗操作后的病人易 导致本菌感染，该菌常常具有多重耐药的特点，因此其所造成的感染难以治愈，病死率高。 而近年证实整合子介导的多重耐药基因也是造成铜绿假单胞菌多重耐药的主要原因之一 [4]。 本研究显示，铜绿假单胞菌在呼吸道的感染占首位为 54.5%（86/158），这与大多 数文献的报导相符合[5]究其原因，可能与铜绿假单胞菌容易定植于呼吸道，且由于气管插 管、流感病毒感染及其他各种炎症等因素损害了呼吸道黏膜，在鞭毛或蛋白酶作用下，细 菌易于移生、粘附有关。伤口创面也较易受其侵害，检出率 32.9%（52/158），居第二 位，与其存在广泛及医院环境的隔离消毒程度关系颇大。实验证明，我院患者分离的铜绿 假单胞菌对多种抗生素出现高耐药，尤其是表现出对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、 单环 β-内酰胺类以及磺胺类等的多重耐药性，更是不容忽视。 研究表明 1 型整合子在铜绿假单胞菌耐药性产生的遗传机制上起着重要作用，它是引 起细菌多重耐药的重要因素。由于抗生素使用量和种类日趋增多，使细菌生存面临更大的 抗生素选择压力。本次研究客观反映了我院铜绿假单胞菌的整合子携带情况，分析本次结 果发现在 158 株铜绿假单胞菌中检出 42 株整合子阳性，检出率为 26.6%，与其他报道铜 绿假单胞菌整合子检出率不完全相同[6]，这可能是由于地域的不同所造成的，也可能与菌 株的来源有关。整合子阳性的细菌表现出多重耐药性比整合子阴性菌高，证实了整合子介 导了多重耐药性产生。但由于铜绿假单胞菌耐药机制比较复杂，耐药性还与抗菌药物作用 的靶位改变、OprD 蛋白缺失引起的菌膜通透性下降、菌体细胞膜上主动外排泵系统的上 调以及产生 B 一内酰胺酶等机制有关，对于铜绿假单胞菌的耐药机制还有待于进一步研究， 以采取有效措施控制其耐药性传播。抗生素的使用越广泛，使携带新耐药基因的优势菌越 多，并导致携带耐药基因菌群量更大，为 1 类整合子多重耐药细菌提供了选择性压力，可 能使其耐药种类更多，传播更广泛。因此，这种耐药机制引起的细菌耐药应该引起临床的 足够重视，加大监测力度，预防医院感染的发生。 摘要依托咪酯诱导期间容易发生肌震颤，肌震颤是由不正常的神经活动所导致，肌震 颤会导致肌纤维损伤和肌痛等不良后果。现就肌震颤机理与后果以及药物对肌震颤的影响 作一综述。 关键词依托咪酯肌阵挛 1964 年合成依托咪酯（etomidate,amidate,hypnomidate,乙咪酯）后，1972 年 推荐入临床。此药为咪唑类衍生物，系催眠性静脉麻醉药。依托咪酯起效甚快、诱导平稳, 适合于心血管疾病、呼吸系疾病、颅内高压等疾病，以及不宜采用其他药物的患者施行麻 醉诱导[1]，曾一度受到人们的欢迎，临床应用较多,也存在一些不良反应，例如注射部位 疼痛；肌震颤或不自主肌肉运动、肌痉挛等不良反应[2]。患者肌震颤后出现的肌痛、增加 饱食患者的误吸率等不良后果给麻醉医生带来了用药顾虑，为使该药进一步广泛应用，减 少依托咪酯引发的肌震颤成了重要研究内容。 1 依托咪酯引发肌震颤的机理与后果 1.1 肌震颤的机理 肌束颤动是肌震颤的特殊术语，如同经典肌痉挛，肌束颤动是由于不正常的神经活动 所导致。参照 Blitt 分级评分[3]，肌震颤程度由弱到强分为四级：0 分:无肉眼可见的肌束 收缩；1 分：肢体末端微弱收缩；2 分：面部、躯干、四肢肌肉轻度收缩；3 分：面部、躯 干、四肢肌肉强烈收缩。依托咪酯引发肌震颤的发生率为 10﹪～65﹪，发作持续时间一 般为 3～10min，用药总量大或静滴时间长，则发生率高。肌震颤的发生机理目前尚不清 楚，Ulsamer 等[4]提出可能是由于脊髓水平未被抑制而脊髓上水平被抑制所致；也有可 能是由于大脑皮质被抑制而皮质下结构(包括锥体外系统)脱抑制所致；王新华[5]提出：达 到脑内黑质、纹状体等部位的依托咪酯与这些部位的内源性多巴胺竞争多巴胺受体，产生 竞争性抑制作用，因而引起类似于上述部位内源性多巴胺减少症状，即肌震颤；另外，肌 阵挛全身性大发作与惊厥、癫痫发作表现相似，目前研究表明肌震颤时脑电图始终无惊厥 波出现，依托咪酯诱导期间所引发的肌震颤与惊厥无关,因此，肌震颤的发生与去皮层抑制 可能有关[6]。 1.2 肌震颤的后果 ① 肌痛，肌震颤时肌纤维受损,可产生肌痛，此外，肌纤维在收缩时对肌梭的牵拉，也 可导致肌痛的出现。②血清钾升高，阵挛明显的病人血清钾略升高，可能肌纤维成束收缩， 导致肌纤维受损，钾释放入血有关[7]。③脑代谢率增高，这对存在脑缺血缺氧的病人可能 不利；④增加饱食患者的误吸率；⑤机体能量消耗增加；⑥增加眼内压。 2 药物对依托咪酯引发肌震颤的影响 2.1 苯二氮卓类对肌震颤的影响 预先给予咪唑安定使患者安静后，当注射依托咪酯诱导时平稳而迅速，肌震颤发生率 极低，另外术前用药也可以减少肌震颤发生；同作为苯二氮卓类镇静药的地西泮其术前的 镇静作用是肯定的,但较早就有报道在抑制依托咪酯引发肌震颤或阵挛上并无明显的作用 [8‘9]。国内王英峰[10]等率先给予咪唑安定或生理盐水后静脉注射 0.3mg/kg 依托咪酯； 结果实验组肌震颤发生率为 5%，对照组肌震颤发生率为 66%，两组血压心率在插管时有 显著差异，对照组血压升高明显。另一实验[11]给予咪唑安定 0.030～0.075mg/kg 体重， 结果实验组肌震颤发生率为 10%以下。Schwarzkopf 等[12]研究认为麻醉诱导前静脉注 射咪唑安定 0.015mg/kg 可有效的降低依托咪酯引发肌震颤的发生率 20%,且有剂量依赖 性。Huterl[13]等提出咪唑安定 0.015mg/kg 可有效的降低依托咪酯在心脏复率病人中 引发肌震颤的发生率为 10%。咪唑安定抑制肌震颤机理还不是很清楚，可能是（1）咪唑 安定通过与多巴胺受体上的苯二氮卓类调控点结合，增强多巴胺介导的氯离子内流，使膜 电位向超级化方向偏移，对电兴奋性起抑制作用[14]。（2）与咪唑安定抑制皮下结构有 关，也可能是咪唑安定加深麻醉及本身所具备的肌肉松弛等特性有关[16]。无论机制如何 我们可以肯定的是：预先给予 0.075mg/kg 咪唑安定患者能够安静入睡，当注射依托咪酯 诱导时平稳而迅速，肌震颤发生率极低，并且能有效地预防依托咪酯诱导插管时出现的高 血压反应，不增加氧耗；另外小剂量咪唑安定(0.03mg/kg)就有很突出的顺行性遗忘的作 用[15]，通过依托咪酯和具有抗焦虑、催眠、抗惊厥、肌肉松弛及顺行性遗忘作用的咪唑 安定预注或复合使用，可以对依托咪酯引发的肌震颤以及插管时血压升高具有一定的抑制 作用。 2.2 阿片类药物对肌震颤的影响 关于阿片类药物对依托咪酯引发肌震颤的影响，国内报道较少，国外研究表明芬太尼、 瑞芬太尼、舒芬太尼等阿片类药物均能很好的抑制依托咪酯引发的肌震颤且没有明显的副 作用，至于抑制肌震颤的机理还不是很清楚，这可能与阿片类药物的作用机制涉及脊髓和 脊髓以上多个中枢神经系统部位有关。 2.2.1 芬太尼 芬太尼能减少依托咪酯辅助硬膜外麻醉时的肌肉不协调运动，芬太尼复合依托咪酯在 人工流产等短小手术中不仅可以镇痛，还可以减少肌震颤。国内有类似报道，另外， Stockham[17]报道：给予芬太尼 100μgg、250μgg、500μgg 后依托咪酯引发肌震颤的发 生率分别为 33%、13%、0%，但有呼吸抑制现象，芬太尼对依托咪酯引发肌震颤的影响 成剂量依赖性，并且随着剂量增加呼吸抑制程度增强。芬太尼抑制肌震颤机理尚不清楚， 可能是芬太尼在血浆中达到一定浓度时会抑制脊髓丘脑束在上行至中脑时发出一分支于网 状结构的突触，使网状结构中的易化区的抑制作用增强或使纹状体中的多巴胺增加，乙酰 胆碱减少，从而抑制依托咪酯可致肌肉不协调运动的反应。 2.2.2 瑞芬太尼 瑞芬太尼能否抑制肌颤国内尚没有报道。Kelsaka[18]等将患者随机分为二组 I 组为 对照组(注射 5ml 生理盐水)；Ⅱ组为实验组组为实验组(注射 1μgg/kg 瑞芬太尼)。术前口服咪达唑仑， 术中常规监测。持续 1min 预注实验剂量后观察 2min，注射结束 2min 后，两组均在 1min 内持续静脉注射依托咪酯 0.3mg/kg，观察肌震颤并评分，1min 后给予芬太尼、维 库溴铵诱导。结果显示：实验组肌震颤发生率为 6.67%，而对照组肌震颤发生率为 70%，并且实验组与组对照组相比，血压、心率无显著差别。瑞芬太尼为芬太尼族中的最 新成员，其半衰期极短暂(<10min),持续静滴不产生蓄积现象，不良反应小，为一较理想 的高效、速效、短效的麻醉性镇痛药，对循环、呼吸、神经系统的作用呈剂量依赖型，对 肝、肾功能无损害。瑞芬太尼减少依托咪酯肌震颤的机理目前还不清楚。 摘要：中医药技术创新与知识产权保护之间有着密切的关系。知识产权保护制度是在 技术创新中产生和发展起来的，中医药技术创新离不开知识产权保护制度。中国在知识产 权制度建设上虽然有了较大的进步，但推进中医药技术创新过程中仍存在着很多问题，应 该采取有效措施加以解决。