栀子苷镇痛抗炎药理作用论文

摘要：目的研究栀子苷的镇痛和抗炎作用。方法小鼠热板实验，醋酸诱发小鼠扭体反 应实验，栀子苷对二甲苯致小鼠耳肿胀实验，栀子苷对醋酸诱发小鼠毛细血管通透性实验， 栀子苷对角叉菜胶致小鼠足肿胀实验等。结果栀子苷 25mg/kgmg/kg 剂量（P＜0.05mg/kg）能延长能延长 热刺激所致小鼠痛觉反应时间，栀子苷 5mg/kg0mg/kg 剂量组和 12.5mg/kgmg/kg 剂量组对醋酸诱 发小鼠扭体反应有明显的抑制作用（P＜0.05mg/kg）能延长，最大扭体次数减少百分率可达 5mg/kg5mg/kg%，具 有一定的镇痛作用；栀子苷 12.5mg/kgmg/kg 剂量组（P＜0.05mg/kg）能延长和 25mg/kgmg/kg 剂量组（P＜ 0.01）能延长对二甲苯致小鼠耳肿胀均有明显的抑制作用，栀子苷大剂量（5mg/kg0mg/溶液 kg）能延长组 能导致腹腔毛细血管渗透液的吸光值显著降低（P＜0.01）能延长，即对急性炎症渗出有较明显 的抑制作用；栀子苷对角叉菜胶致小鼠足肿胀没有明显抗炎作用，炎症渗出液中 PGE2 的 含量与对照组比较无明显差异，其抗炎作用可能与 PGE2 释放没有关系。结论栀子苷有一 定的镇痛和抗炎作用。 关键词：栀子苷镇痛作用抗炎作用 栀子是药食两用传统中药，药用栀子是茜草科植物栀子 GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果实，性寒味苦，归心、肺、三焦经，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之 功效。用于热病心烦，黄疸尿赤，血淋涩痛，血热吐衄，目赤肿痛，火毒疮疡等证，外治 扭挫伤痛。栀子果中含有含环烯醚萜苷类成分，其中栀子苷(geniposide)geniposide)含量最高（含量 可达 6％）能延长，在栀子的药用效果中起重要作用。本实验利用栀子黄色素生产过程中的废液 提取和精制栀子苷，主要对精制的栀子苷进行了镇痛和抗炎作用研究。 一、材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药品与试剂杜冷丁，宜昌人福药业有限公司产品；栀子苷，本实验室提取纯化； 氢化可的松注射液，天津药业集团新郑股份有限公司产品；伊文思蓝，上海化学试剂采购 供应站分装厂产品；角叉菜胶，Sigma 公司。 1.1.2 动物昆明种小鼠，18～22g，湖北省动物防疫中心提供。 1.2 方法 1.2.1 栀子苷对小鼠镇痛作用的实验研究昆明种雌性小鼠 40 只，随机分为 5mg/kg 组：生理 盐水阴性对照组、栀子苷大剂量组（5mg/kg0mg/kg）能延长、栀子苷中剂量组（25mg/kgmg/kg）能延长、栀子 苷小剂量组（12.5mg/kgmg/kg）能延长、杜冷丁阳性对照组。分组前进行筛选，调节小鼠热板测痛仪， 使温度保持在（5mg/kg5mg/kg.0±0.2）能延长℃，每次取 1 只小鼠，放入测痛仪内，记录自放入到出现舔 后足所需的时间(geniposide)s)作为该鼠的痛阈值。凡小于 5mg/kgs 或大于 30s 出现舔后足者，以及喜跳跃 者，一律弃去不用。取合格者进行分组，标记，重新测量两次，取平均值作为该鼠给药前 的基础痛阈值。 栀子苷大、中、小剂量组连续 3d 按时按量皮下注射给药，给药 1 次/d，给药时间间 隔 24h/次。每天给药前，先称小鼠体重，按小鼠的体重计算给药量后再给药，阴性对照组 给予等量体积的生理盐水。第 4 天时，给药组称重后按小鼠体重皮下注射给药，5mg/kg 组按顺 序给药。每组给药后 30，60，90，120min 分别测定小鼠痛阈值。若小鼠在热板上停留 60s 后仍无痛反应，则取出，按 60s 计算。比较给药组和对照组的差异情况，作组间 t 检 验。 1.2.2 栀子苷对醋酸诱发小鼠扭体反应的影响 取昆明种小鼠 40 只，雌雄各半，按性别体重随机分为 5mg/kg 组，每组 8 只，打点标记后 送入动物房饲养。5mg/kg 组对应的分别是：生理盐水阴性对照组、栀子苷大剂量组（5mg/kg0mg/ kg）能延长、栀子苷中剂量组（25mg/kgmg/kg）能延长、栀子苷小剂量组（12.5mg/kgmg/kg）能延长、杜冷丁阳性对 照组。前 3d 给药同“1.2.1”项。第 4 天时，称完小鼠体重后，空白对照组和给药组仍然按 时按量皮下注射给药，并且与前次给药时间间隔 24h，杜冷丁阳性对照组最后给药。依每 只小鼠给药时间为准，杜冷丁阳性组小鼠给药 300min 后即阴性组及给药组给药 1h 后， 腹腔注射 0.6%的醋酸溶液 0.1ml/10g。观察扭体反应并计算 20min 内小鼠扭体数。比 较给药组和对照组的差异情况，作 t 检验。 1.2.3 栀子苷对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 取昆明种小鼠 40 只，雄性，体重 18～22g，按体重随机分为 5mg/kg 组：生理盐水阴性对 照组、栀子苷大剂量组（5mg/kg0mg/kg）能延长、栀子苷中剂量组（25mg/kgmg/kg）能延长、栀子苷小剂量组 （12.5mg/kgmg/kg）能延长、氢化可的松阳性对照组。每组 8 只，打点标记后送入动物房饲养。前 3d 给药同“1.2.1”项。第 4 天时，称完小鼠体重后，前 4 组仍然按时按量皮下注射给药， 并且与前次给药时间间隔 24h，氢化可的松阳性对照组最后给药。以每只小鼠给完药的时 间为基准，氢化可的松阳性对照组给药 30min 后，给药组给药 1h 后，各组小鼠右耳前后 两面涂抹二甲苯（0.02ml/只）能延长；以每只小鼠致炎时间为准，15mg/kgmin 后将小鼠脱颈椎处死， 沿耳廓基线剪下两耳，用 8mm 直径打孔器于左右耳廓相应部位各打一耳片，电子天平称 重。以左右耳片的重量之差作为肿胀度。算出肿胀度和肿胀抑制率（%）能延长，并与对照组比 较（t 检验）能延长。 1.2.4 栀子苷对醋酸诱发小鼠毛细血管通透性的影响 小鼠分组同“1.2.3”项。前 3d 给药同“1.2.1”项。第 4 天时，称完小鼠体重后，3 个给 药组及阴性对照组仍然按时按量皮下注射给药，并且与前次给药时间间隔 24h。氢化可的 松阳性对照组最后给药，皮下注射氢化可的松。以每只小鼠给完药的时间为基准，氢化可 的松阳性对照组给药 30min 后，空白及给药组给药 1h 后，尾静脉注射 0.5mg/kg%的伊文思蓝 溶液 0.1ml/10g 体重，后立即腹腔注射 0.6%醋酸溶液 0.1ml/10g 体重，以注射完醋酸 溶液的时间为基准，20min 后脱颈椎处死小鼠，剪开腹腔，用 8ml 生理盐水分 4 次清洗 腹腔，合并洗涤液，3000r/min 离心 15mg/kgmin，取上清液，于 5mg/kg90nm 处测定其吸光值。 1.2.5mg/kg 栀子苷对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响 小鼠分组同“1.2.3”项。前 3d 给药同“1.2.1”项。第 4 天时，称完小鼠体重后，空白对 照组和 3 个给药组仍然按时按量皮下注射给药，并且与前次给药时间间隔 24h，氢化可的 松阳性对照组最后给药。依每只小鼠给药时间为准，氢化可的松阳性组小鼠给药 30min 后，阴性及给药组给药 1h 后致炎，即在每只动物右后足注射 1%角叉菜胶 5mg/kg0μll 致炎；以 每组小鼠致炎时间为准，致炎后 3h 处死小鼠，称左、右后足重量，以左、右后足重量的 差值作为肿胀厚度。比较给药组和对照组的差异情况，作 t 检验。 1.2.6 栀子苷对炎症组织渗出液中炎症介质含量 PGE2 的 OD 值的影响 将第“1.2.5mg/kg”项实验中小鼠的致炎足剪碎后放入相应的标记瓶中，各瓶中加入 3ml 生 理盐水，将致炎足浸泡 24h。浸泡完毕以后将浸出液离心 3000r/min，5mg/kgmin。再取上清 液 0.1ml，加入到装有 2ml 氢氧化钾-甲醇溶液的试管中，混匀后，取其中的 5mg/kg%混合液于 5mg/kg0℃恒温水浴锅中异构化 20min，再用甲醇稀释到 10ml，于 278nm 波长处测定其 OD 值。比较给药组和对照组 PGE2 含量的差异，并进行组间 t 检验。 二、结果 2.1 栀子苷对小鼠的镇痛作用给药后不同时间痛阈见表 1。表 1 栀子苷对小鼠痛阈值 的影响(geniposide)略) 由表 1 可知，栀子苷中剂量（25mg/kgmg/kg）能延长能延长热刺激所致小鼠在无痛觉反应时间， 具有一定的镇痛作用（P＜0.01）能延长。 2.2 栀子苷对醋酸诱发小鼠扭体反应的影响 扭体反应的抑制率（%）能延长=对照组扭体次数-实验组扭体次数对照组扭体次数×100% 腹腔注射醋酸溶液后，除阳性组外其它各组均出现腹部收缩，躯体扭曲，后肢伸展及 蠕行等扭体反应，见表 2。杜冷丁对醋酸诱发小鼠扭体反应有十分明显的抑制作用，P＜ 0.001；栀子苷 5mg/kg0mg/kg 剂量组和 12.5mg/kgmg/kg 剂量组对醋酸诱发小鼠扭体反应有明显的 抑制作用(geniposide)P＜0.05mg/kg)，最大扭体次数减少百分率可达 5mg/kg5mg/kg%，说明栀子苷对醋酸诱发小鼠扭 体反应具有明显的抑制作用。 栀子苷醋酸诱发小鼠扭体反应的影响(geniposide)略) 2.3 栀子苷对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响结果。 肿胀度（mg）能延长=右耳廓重－左耳廓重 抑制率（%）能延长=阴性对照组小鼠平均耳廓肿胀度-给药组小鼠平均耳廓肿胀度阴性对照 组小鼠平均耳廓肿胀度×100% 用二甲苯致炎后，各组小鼠右耳均可见高度红肿。结果表明，氢化可的松组（P＜ 0.01）能延长和栀子苷 12.5mg/kgmg/kg 剂量组(geniposide)p＜0.05mg/kg)，25mg/kgmg/kg 剂量组(geniposide)P＜0.01)对二甲苯致 小鼠耳廓肿胀均有明显的抑制作用，且栀子苷对小鼠耳廓肿胀的抑制作用表现出良好的量、 效关系，其抑制作用随剂量的减小而有所增强。 2.4 栀子苷对醋酸诱发小鼠毛细血管通透性的影响结果见表 4。表 4 栀子苷对醋酸诱 发小鼠腹腔毛细血管通透性的影响(geniposide)略) 结果显示：与生理盐水组比较，栀子苷和氢化可的松均可降低由醋酸引起的小鼠毛细 血管通透性的增加，其中栀子苷大剂量组和氢化可的松能导致腹腔毛细血管渗透液的吸光 值显著降低（P＜0.01）能延长，即对急性炎症渗出有明显的抑制作用。 2.5mg/kg 栀子苷对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响结果。栀子苷对角叉菜胶致小鼠足肿胀的 影响(geniposide)略) 抑制率（%）能延长=对照组平均肿胀厚度-给药组平均肿胀厚度对照组平均肿胀厚度 ×100% 角叉菜胶诱发小鼠足水肿的急性非感染性炎症模型，肿胀高峰在致炎后 3～5mg/kgh，其模 型稳定，重现性好，常用于筛选抗炎药物。小鼠实验结果表明栀子苷对角叉菜胶致小鼠足 肿胀没有明显抗炎作用，而氢化可的松对角叉菜胶致小鼠足肿胀有十分明显的抑制作用 （P＜0.01）能延长。 2.6 栀子苷对小鼠炎症组织渗出液中炎症介质含量 PGE2 的 OD 值的影响结果见表 6。表 6 栀子苷对小鼠炎症组织渗出液中介质（PGE2）能延长的影响(geniposide)略)公务员之家 由表 6 可知，氢化可的松炎症渗出液中 PGE2 的含量明显低于对照组，其抗炎作用与 抑制 PGE2 释放有一定关系，P＜0.01。栀子苷对炎症渗出液中 PGE2 的含量则与对照组 比较无明显差异，其抗炎作用可能与 PGE2 释放没有关系。 三、讨论 通过热板法来研究栀子苷对小鼠镇痛作用的效果，结果表明栀子苷中剂量能延长热刺 激所致小鼠痛觉反应时间；并且，栀子苷大剂量组和小剂量组能够显著抑制醋酸引起的小 鼠的扭体次数，抑制率可达到 5mg/kg5mg/kg%，表明栀子苷具有一定的镇痛作用。 通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响实验研究，发现栀子苷中剂量和小剂量对小鼠的耳 廓肿胀有明显的抑制作用。栀子苷可降低由醋酸引起的小鼠毛细血管通透性的增加，栀子 苷大剂量组可显著降低毛细血管的通透性，对急性炎症渗出有明显的抑制作用。 栀子苷对角叉菜胶致小鼠足肿胀却没有明显抗炎作用，对炎症组织渗出液中的炎症介 质 PGE2 的释放也没有明显影响。 摘要：一些实验研究及临床资料证明，有些抗菌药尤其是 β-内酰胺类抗生素在治疗革 兰氏阴性菌感染时，有诱导大量内毒素释放的副作用，在临床上可能引起或加重内毒素血 症。不同类型抗菌药诱导内毒素释放的程度与其对不同类型青霉素结合蛋白(geniposide)PBP)的亲和 性有关，抗菌药与 PBP3 或 PBP2 结合所造成的内毒素释放的量较高。因此在抗菌药的研 究设计中，除了要考虑其杀菌效力外，还应考虑可能诱导内毒素释放的问题。在败血症治 疗中也应采取合理的治疗方案，以防止或减轻内毒素血症的发生。 关键词：抗菌药内毒素青霉素结合蛋白 内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖成分，具有广泛的生物活性。内毒素对 机体造成双重影响:少量内毒素刺激机体时，能增强特异性及非特异性免疫力，诱导产生干 扰素等；而大量内毒素进入机体循环时，可造成广泛而强烈的病理反应，如弥漫性血管内 凝血、多器官功能衰竭及休克等。内毒素在革兰氏阴性杆菌引起的感染性休克中起着关键 作用。对于革兰氏阴性菌败血症病人，有些广谱抗菌药能有效地控制菌血症，但是临床资 料证明病人的死亡率仍然很高，其原因可能与抗菌药诱导细菌释放内毒素有关。由于在抗 菌药治疗的过程中，随着细菌的裂解，内毒素从细菌的细胞壁外膜释放后进入血液循环， 因而可能加重内毒素血症，从而促进一系列的炎症反应，造成机体严重而广泛的病理损伤。 一、抗菌药诱导的内毒素释放 在体外细菌培养系统中，已发现多种抗菌药如 β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类 药物等均能引起不同程度的内毒素释放，其中 β-内酰胺类抗生素(geniposide)如氨苄西林，头孢噻肟， 头孢他啶，氨曲南等)能诱导多种细菌包括野生菌和突变菌(geniposide)如大肠埃希氏菌，铜绿假单胞 菌，肺炎克雷伯氏菌，流感嗜血菌等)释放大量的内毒素，在这些抗菌药处理的细菌培养上 清液中能检测到内毒素含量比无抗菌药处理者高几倍甚至几十倍。β-内酰胺类抗生素诱导 的内毒素释放常常与其造成的细菌溶解伴随发生，并与细菌溶解程度有一定关系。内毒素细胞因子级联反应所造成的全身炎症过程是发生内毒素休克的重要环节。抗菌药作用于细 菌后，由于细菌裂解及伴随的内毒素释放到培养上清液中，其上清液可刺激巨噬细胞及血 管内皮细胞等产生大量的肿瘤坏死因子(geniposide)TNF))和白细胞介素-6(geniposide)IL-6)，这些炎性因子的大量 产生可促进内毒素休克的发生。 有些动物体内实验可观察到与体外实验一致的结果。给大肠埃希氏菌性腹膜炎家兔注 射庆大霉素后，动物血液中细菌数量急剧减少，但血浆中内毒素含量较未治疗者明显增高。 用氨苄西林治疗幼年大鼠流感嗜血菌性腹膜炎，造成较多的内毒素释放入血液循环。烧伤 后感染肺炎克雷伯氏菌的败血症小鼠，经头孢他啶、氨曲南、亚胺培南治疗后，小鼠血液 中内毒素含量明显增高，同时内毒素激活巨噬细胞产生大量的 IL-6。大肠埃希氏菌性脑膜 炎家兔，经美罗培南和头孢噻肟治疗后，在脑脊液中可检测到高含量的内毒素，同时脑脊 液中 TNF) 浓度也增高。不同类型的抗菌药所诱导的内毒素释放水平有所不同，如拉氧头孢 对菌血症的清除作用与庆大霉素相似，但其诱导内毒素释放的量比庆大霉素高 20 倍。用 D-半乳糖胺处理小鼠后，再造成大肠埃希氏菌性腹膜炎模型，发现用头孢他啶治疗比用亚 胺培南治疗引起更多的小鼠死亡，推测头孢他啶诱导更多的内毒素释放。 虽然动物体内的研究结果不能外推到人，但这些研究证据提示了抗菌药促进内毒素释 放，加重内毒素血症的可能性。有些革兰氏阴性菌败血症患者在接受抗菌药治疗后，尽管 血液中细菌数减少或消失，但大部分病人呈现血浆中游离及总内毒素含量增高(geniposide)游离内毒素 含量升高 2~5mg/kg0 倍)。流感嗜血菌感染的脑膜炎患儿，在接受头孢他啶治疗后，所有患儿脑 脊液中游离内毒素含量均增高，同时脑脊液中乳酸盐及乳酸脱氢酶增高及葡萄糖下降，提 示内毒素增高导致炎症加重。用抗菌药治疗泌尿系感染后，尿液培养显示细菌数下降，但 尿中内毒素含量却明显增高。内毒素释放的程度与所用的抗菌药种类有关，其中 β-内酰胺 类抗生素所造成的内毒素增高更为明显。这些临床资料表明，革兰氏阴性菌败血症患者经 有些抗菌药治疗后，病人的菌血症减轻，但内毒素血症改善不明显或反而加重，这可能是 病人高死亡率的原因之一。 二、青霉素结合蛋白与抗菌药诱导的内毒素释放 青霉素结合蛋白(geniposide)PBP)是存在于革兰氏阴性杆菌细胞浆膜外周间隙中的一类酶蛋白质。 有些抗菌药如 β-内酰胺类抗生素的抑菌作用机制就在于与 PBP 结合，使其活性受到抑制， 从而引起细胞壁肽聚糖的合成受阻及细菌内溶解酶的激活，因而造成菌体裂解和死亡。但 与此同时，细胞壁外膜上的内毒素可能被释放出来。不同类型的抗菌药诱导内毒素释放的 能力与其对不同 PBP 的亲和力有关。抗菌药与 PBP1 结合可造成细菌快速溶解；而抑制 PBP2 则使杆菌生长成球形体；抑制 PBP3 则使细菌生长成长丝状。 主要结合于 PBP2 和 PBP1 的抗菌药(geniposide)如亚胺培南)作用于革兰氏阴性杆菌后，能很快 引起内毒素释放(geniposide)与细菌作用后 1－2h)；而主要结合于 PBP3 的抗菌药(geniposide)如头孢噻肟，头孢 他啶，氨曲南等)诱导内毒素的释放较晚(geniposide)作用后 4h 左右)。实验证明 PBP3 抑制剂比 PBP2 抑制剂所造成的内毒素释放量要高得多，这是由于与 PBP3 结合抑制了细菌隔膜的形成， 从而使细菌生长成长丝状，因此细菌的质量变大及内毒素的合成不断增高。一般来说，每 种 β-内酰胺类抗生素不仅仅作用于一种 PBP，与何种 PBP 结合与所用剂量有关。例如， 所谓的 PBP3 抑制剂(geniposide)如头孢噻肟，头孢他啶)在较低浓度(geniposide)≤最低抑菌浓度)时，主要与 PBP3 结合，诱导细菌长丝形成；而在较高浓度时，则对 PBP1 有较高的亲和力，因而造 成细菌快速溶解。主要作用于 PBP3 的抗菌药在低于最低抑菌浓度时，仍能诱导大量的内 毒素释放而不伴有明显的细菌溶解，此时内毒素的释放产生于长丝形成时非溶解性细胞壁 损伤。 三、防止抗菌药诱导的内毒素释放