道地药材质量评价论文

1 以性状鉴定为主的阶段 从《神农本草经》所收载的 365 种药物中，其中不少药物从药名上就带有道地药材的 色彩，如巴戟天、秦皮、吴茱萸、阿胶等。李时珍的《本草纲目》对道地药材的记载就更 加明确，如在对麦冬的记载中，有“浙中来者甚良”，对薄荷的记载中，有“今人用药，多以 苏州为胜”。“良”“胜”自然都是指药材的质量好。而在科学不够发达的古代，人们评价道地 药材的质量只能是通过性状鉴定的方法，即通过眼观、手摸、鼻闻、口尝、水试、火试等 简单的方法。如宁夏的枸杞以粒大饱满、色红、肉厚、油润、籽少、味甜微苦等性状特征 优于其他产地枸杞。又如根茎上含有的大量朱砂点是江苏茅山所产的道地药材茅苍术的重 要质量指标。在对传统的道地药材如四大怀药、浙八味的性状鉴别中，老药工、药农积累 了大量的经验，在科学技术不够发达的时期，它对于道地药材的鉴定和发展起了十分重要 的作用。 由于性状鉴定主要依靠鉴定者丰富的经验和感觉，这其中不可避免地带入了鉴定者的 一些主观因素。由于每一个鉴定者的鉴别经验的差异，加上信息交流的限制，性状鉴定的 准确性就不可能很高。 2 显微鉴定的形成与发展 用显微鉴定的方法评价生药的质量是在一定的历史背景下形成的，19 世纪以后，显微 镜的发明和生药解剖图谱的发表为生药的显微鉴别打下了物质基础。由于生药的各种组织 形态均具有较稳定的显微特征，利用显微镜来观察生药的组织结构、细胞形状及内含物， 可以成为生药品种鉴别和质量鉴定的一个重要手段。它弥补了性状鉴定的不足，尤其是在 对破碎药材及粉碎后的药材的鉴定中发挥了重要作用。 道地药材的显微鉴别特征也成为监测道地药材的质量、区分道地药材和非道地药材的 一个重要依据。例如：道地药材茅苍术与北苍术相比，其横切面的显微特征表现为皮层中 的油室直径大、数量多，一般其油室直径达 450μmμmm，而北苍术的油室直径约为 270μmμmm。 再如，道地药材杭麦冬与其它麦冬相比，前者的块根横切面显示韧皮部束 15～24 个，与 木质部束相间排列，而短葶山麦冬韧皮部束 8～17 个。作为道地药材的“味连”，其根茎横 切面有单个散在或数个成群的石细胞，而“云连”的皮部及髓部均无石细胞。通过显微镜可 明显观察到这些差异。很显然。显微鉴别为道地药材的质量评价提供了比较可靠的依据， 使其鉴别标准更加客观，鉴别的准确度大大提高。 随着计算机的发展，显微鉴别有了进一步的发展，目前，有些学者运用显微镜、计算 机图形学及自动图像处理系统，实现了某些道地药材的显微刻划三维化。如四川中药研究 所与重庆大学电子信息学院合作建立了麦冬、附子、川贝等道地药材组织细胞计算机三维 动态显示与立体鉴别系统，与攀枝花钢铁公司设计院合作完成了黄连、杜仲等道地药材所 含无机成分的显微定位定量研究［1］。这显然为传统的显微鉴定开辟了一个新天地，也 为道地药材的质量评价提供了更为先进的技术依据。 3 理化鉴别的迅速发展 在化学和分析化学发展到一定阶段后，人们开始关注药材中的活性成分，因而，19 世 纪后半叶起，开始以药材中的化学成分作为衡量药材质量的标准。这种方法很快运用到道 地药材的质量评价中，如郭兰萍等［2］在研究中发现茅苍术道地药材的挥发油组成特征 不同于非道地苍术，丁平等［3］发现阳春砂道地药材和与非道地药材挥发油组分含量差 异显著。张重义、李萍等［4］对道地与非道地产区的金银花的质量作了比较，对绿原酸、 总黄酮、环烯醚萜、常青藤、皂苷元、齐墩果酸等进行含量测定，并用 SAS 统计分析系统 进行聚类分析。 20μm 世纪 60μm 年代后，在对道地药材的化学成分进行研究时，现代的分析手段不断地被 运用，色谱法和光谱法越来越多地被用于道地药材和非道地药材的对比研究，很多学者用 化学指纹图谱对道地药材进行识别鉴定。高分辨率气相色谱（HRGC）、高效液相色谱 （HPLC）、毛细管电泳色谱（HPCE）等已越来越广泛地进入到生药学的研究领域，成为 生药质量评价的重要方法和手段，尤其是在对道地药材的鉴别中，越来越多的学者利用这 些现代化分析手段，完成了部分道地药材的指纹图谱，如马英丽等［5］分别采用指纹图 谱和模式识别的方法对大黄、三七、黄芪等药材的道地性进行了分析。这些现代化分析手 段的应用，为道地药材的质量评价提供了更加可靠的依据。 4 分子生物技术用于道地药材的质量评价 1995 年，黄璐琦［6］首次提出了“分子生药学”的概念，引起了生药学界的强烈共鸣。 20μm0μm0μm 年 6 月，《分子生药学》的正式出版，使原有的生药学跨入了一个新的时代，在生 药的质量鉴别方面也开创了一个新纪元。选用适当的 DNA 分子标记技术，可以在属、种、 亚种居群或个体水平上对研究对象进行准确的鉴别。近年来，在 PCR 技术基础上发展起来 的随机扩增的 DNA 多态性分析(RAPD)RAPD)，用于道地药村的鉴别，通过 RAPD 技术找出道地 药材的 DNA 片段，对此进行测序，进而制备 DNA 探针来检测相应的药材，成为判断药材 的道地性的一个便捷、准确的鉴别方法。而遗传物质 DNA 及初生和次生代谢过程中酶系 统发生的变异，是道地药材鉴别的理论依据。陈永久等［7］利用的 RAPD 技术对冬虫夏 草的研究为冬虫夏草的药材道地性研究提供了分子水平的支持依据，肖小河等［8］对姜 黄的研究表明，RAPD 技术可作为姜黄属药用植物的分类鉴定与道地性评价的新手段。魏 玉清等［9］运用 RAPD 技术对宁夏枸杞展开研究和质量评价，从 RAPD 指纹图谱的分析 中得出结论是：RAPD 技术用于枸杞道地品种的确定及药材真伪的鉴别是有效的。据文献 统计，至 20μm0μm3 年，对重要的植物药的分子鉴定研究已完成了六十多个类别，其中有相当 一部分是道地药材。 分子遗传标记技术的兴起和逐步成熟，在道地药材的质量评价方面充分显示了其不可 比拟的优势，从基因水平上对药材进行研究，使道地药材的质量评价有了更为准确、可靠 的依据，解决了性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别中不能阐述和表达的问题，是道地药材的 质量评价上的重大突破。 综上所述。道地药材的质量评价始终是生药学中一个引人注目的问题，随着时代的进 展，现代的分析技术和仪器被用于生药的鉴定，在道地药材的鉴定中，多种鉴别方法的综 合运用，将会使鉴定结果的准确性越来越高。对于我国道地药材的发展无疑是一个推进。 1 材料 1.1 受试物妇洁颗粒，深棕色膏剂，每克膏相当于生药 3.0μm29g，由本所提供，批号 0μm20μm820μm；阳性对照药：妇乐冲剂：规格 6g/袋，山东泰安红旗制药厂生产，批号 0μm20μm30μm9。 1.2 菌种、动物与试剂实验菌株，本实验共选用 7 种细菌。包括金黄色葡萄球菌 12 株、 表皮葡萄球菌 10μm 株、大肠杆菌 14 株、肠球菌 10μm 株、普通变形杆菌 12 株、乙型溶血性 链球菌 6 株，共计 64 株。以上菌株均为山东大学齐鲁医院收集的临床分离菌株。全部菌 种均进行常规方法鉴定；金黄色葡萄球菌 ATCC25922、大肠埃希氏菌 ATCC25923，均 来源于中国药品生物制品检定所。以上述菌株作为试验中的质控菌株，各菌分别稀释至终 浓度为 10μm5cfu/ml 备用。健康昆明种小鼠，体重 18～22g，由山东鲁抗医药集团提供， 合格证号：鲁动质字 D20μm0μm20μm921。营养肉汤，卫生部上海生物制品研究所生产，批号 0μm0μm0μm10μm1；MH 琼脂，上海市医学化验所试剂厂生产，批号 990μm60μm1。 1.3 供试品的配制采用二倍稀释法将妇洁颗粒及妇乐冲剂分别稀释配制成终浓度分别 为 128，64，32，16，8，4，2，1，0μm.5，0μm.25g/L 的含药琼脂平皿培养基，乙型溶血 性链球菌用含有 10μm%脱纤维的兔血含药血液琼脂平皿培养基，冷藏备用。以上操作均在无 菌条件下进行。 2 方法 2.1 实验菌株与标准菌株的最小抑菌浓度（MIC）测定［1］将稀释好的菌液用多点接 种仪分别接种到上述各含不同浓度药物的琼脂平皿培养基的表面上，37℃培养 18h，无细 菌生长的平皿中所含药物的最低浓度即为该药物的最小抑菌浓度(RAPD)MIC)。 2.2 对感染小鼠的体内保护实验［2］实验菌液的制备：将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、 变形杆菌、乙型链球菌分别定量接种于适宜的 MH 肉汤或含 10μm%羊血的 MH 肉汤中，放孵 箱 37℃增菌 6h，取此菌液 0μm.1ml 转种于 10μmmlMH 肉汤或含 10μm%羊血 MH 肉汤中，放孵 箱 37℃孵育 18h，该菌为原菌液，适当稀释后，用 5%灭菌胃膜素配制成感染动物所需浓 度菌液，供实验用。 最小致死量（MLD）实验：将原菌液用 5%胃膜素进行递次稀释。选健康小鼠若干， 雌雄各半，分别腹腔注射不同浓度的各菌液，进行各菌株的最小致 10μm0μm%动物死亡 （MLD）测试，测得金黄色葡萄球菌 MLD 为 5×10μm8cfu/ml，大肠杆菌 MLD 为 5×10μm9cfu/ml，变形杆菌 MLD 为 5×10μm8cfu/ml，乙型链球菌 MLD 为 1×10μm6cfu/ml。 对感染小鼠的体内保护实验：选健康昆明种小鼠 18～22g，雌雄各半，随机分为 5 组， 每组 10μm 只，同时设 MLD 和 1/10μmMLD 各 1 组，分别给每只小鼠腹腔注射菌液 0μm.5mlMLD 菌量，于感染后即刻，6，12，24，48，72h 给各组小鼠不同浓度的药物，观察并记录 感染后小鼠死亡数，连续观察 14d，根据小鼠死亡数，按 Bliss 法计算半数有效剂量 ED50μm 值及 95%的可信限。 3 结果 3.1 妇洁颗粒对 64 株细菌的 MIC 测定妇洁颗粒对大多数试验菌种的 MIC 范围均在 0μm.25～32g/L 之间，MIC50μm 多为 0μm.25～8g/L，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及大肠 杆菌的作用为最强，MIC50μm 分别为 0μm.25，2 和 1g/L，对变形杆菌和肠球菌作用次之， MIC50μm 均为 4g/L，对乙型溶血性链球菌的作用较弱，MIC50μm 为 32g/L。同时，妇洁颗粒 对 2 株标准菌株也有较好的抑制作用，对 ATCC25922，ATCC2592 的 MIC 分别为 2，1g/L。综合上述结果，妇洁颗粒对试验中大部分革兰氏阳性及革兰氏阴性菌均具有较 强的杀灭或抑制作用，抗菌谱较为广泛。结果见表 1。表 1 妇洁颗粒对 64 株细菌的 MIC 测定 3.2 妇洁颗粒对感染小鼠的体内保护实验各组动物感染上述 4 种细菌后 30μmmin 出现怠 动，继而出现卧位，精神萎靡、呼吸急促，死亡多发生在 48h 之内。阳性对照药妇乐冲剂 组动物感染后也出现上述症状。随着用药剂量的增加，死亡时间延迟。妇洁颗粒对金黄色 葡萄球菌、大肠杆菌及变形杆菌造成的体内感染有较好的保护作用，见表 2。由于受药物 浓度的限制，乙型链球菌造成的小鼠体内感染未做出存活率为 10μm0μm%的保护剂量。结果见 表 2。 4 讨论 以上实验结果表明：妇洁颗粒对临床常见大部分革兰氏阳性及革兰氏阴性菌均具有较 强的杀灭或抑制作用，抗菌谱较为广泛。体内保护实验表明，妇洁颗粒对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌及变形杆菌有较好的体内保护作用。表 2 妇洁颗粒对感染小鼠的体内保护实验 临床上引起阴道炎和宫颈炎的常见病原菌有金葡菌、大肠杆菌、变形杆菌等,妇洁颗粒 在临床上对阴道炎和宫颈炎有较好的治疗作用,是与该药对常见致病菌有较强的抑制作用和 较广泛的抗菌谱分不开的。