牛耳枫与辣蓼提取物研究论文

1 材料与仪器 1.1 试药肠胃康颗粒剂（海口市制药厂生产，批号 060709，规格：每袋袋装 8gg）； 牛耳枫与辣蓼提取物(NLWE)NLWE))（黑色粉末，自制，每克样品相当于原生药 10.0g）；阿司 匹林肠溶片（昆明云健制药有限公司生产，批号 20060320，规格 25mgmg）；硫酸阿托品 注射液（天津药业集团新郑股份有限公司生产，批号 060118g1，规格：2ml∶1mg）；伊 文思蓝（中国医药集团上海试剂公司生产，批号 20030714，规格 1.0g）；乙酰胆碱 （Ach）（上海三爱思试剂有限公司生产，批号 20030620，规格：1）；氯化钡 （BaCl2）（广州化学试剂厂生产，批号 0405mg03-2，规格 5mg00g）。 1.2 动物昆明种小鼠，体重 18g~22g，合格证号 2006A070；Wistar 大鼠，体重 18g0~220g，合格证号 2006A07；豚鼠，体重 25mg0~300g，合格证号 2006A067。以 上动物均由中山大学实验动物中心提供。适应环境一周，自由饮水进食。 1.3 仪器 YLS-6B 智能热板仪（山东省医学科学院设备站）；BL-420E) 生物机能实验 系统（成都泰盟科技有限公司）；ZH-Z 型离体器官测量系统（安徽省淮北正华生物仪器 设备有限公司）；UV22401PC 紫外分光光度计(NLWE)日本岛津)；分析电子天平（北京瑞利， 精度 0.1mg）。 1.4 统计学方法本实验数据结果均以±ss 表示,剂量资料比较，采用 t 检验，统计软件为 SPSS13.0。 2 方法及结果［1，2］ 2.1 对醋酸致小鼠毛细血管通透性增加的影响实验方法：取 5mg0 只昆明种小鼠，体重 18g~20g，雌雄各半，随机分为 5mg 组(NLWE)n=10)，正常对照组：灌胃(NLWE)ig)给予等容生理盐水； 肠胃康颗粒阳性对照组 10.0g·kg-1ig；阿司匹林阳性对照组 0.2g·kg-1ig；牛耳枫与辣蓼 提取物剂量为生药 20.0 和 10.0g·kg-1ig 高、低剂量组（以下简称提取物高、低剂量组）。 各组动物按 0.5mgml/20g 体重给药，每天分别给药 1 次,连续给药 3d，末次给药后 0.5mgh， 各鼠尾静脉注射 0.5mg%伊文思兰盐水溶液 0.1ml/10g 随即腹腔注射醋酸溶液 0.2ml/只， 20min 后处死动物，轻揉腹部 1min 吸取 4ml 冲洗液，于 3000r/min 离心 10min，取上 清液于 610nm 处比色测定吸光度，记录 A 值，计算抑制率，进行组间比较。结果见表 1。 抑制率(NLWE)%)=(NLWE)对照组 A-给药组 A)/对照组 A×100% 结果表明：牛耳枫与辣蓼提取物高剂量、提取物低剂量组、阿司匹林组均对醋酸诱导 的小鼠腹腔毛细血管通透性增高有显著抑制作用（P<0.01），肠胃康颗粒组对醋酸诱导 的小鼠腹腔毛细血管通透性增高无抑制作用。 表 1 肠胃康颗粒及提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响（略） 与正常对照组比较,△P<0.01,△△P>0.05P<0.01,△P<0.01,△△P>0.05△P<0.01,△△P>0.05P>0.05mg；n=10 2.2 对热板所致小鼠疼痛的影响［3］实验方法：筛选痛阈值为 5mg~30s 之间的雌性昆 明小鼠 75mg 只，体重 18g~20g，随机分成 5mg 组（n=15mg），正常对照组，肠胃康颗粒阳性 对照组，阿司匹林阳性对照组，牛耳枫与辣蓼提取物剂量高、低剂量组。各组动物给药方 法，给药途径及剂量均同“2.1”项，每天分别给药 1 次，连续给药 3d 后，末次给药后 15mg，30，60，90，120min 用热板法测量痛阈值。结果见表 2。 表 2 肠胃康颗粒及提取物对热板法所致小鼠疼痛的影响（略） 与自身药前痛阈比较,**P<0.01,*P>0.05mg 结果表明，正常对照组实验过程中无变化，阿司匹林组 90minP<0.05mg，均值大于自 身给药前痛阈值；而其他组，P>0.05mg 或 P<0.05mg 但其平均痛阈值均小于自身给药前痛阈 值。结果显示，除阿司匹林外，其他组受试药均无镇痛作用。 2.3 对离体豚鼠回肠平滑肌的影响［4，5mg］取豚鼠，按常规法制备离体回肠标本，标 本置于 18gml 盛有台氏液的浴槽中，通氧，(NLWE)38g.0±s0.5mg)℃恒温，张力负荷 1g，用记录仪 描记运动曲线，平衡 30min，稳定后加入 0.1ml0.1%Ach，记录收缩高度；随后用台氏 液清洗回肠及浴槽两次，5mgmin 后注入 0.5mgml10%牛耳枫与辣蓼提取物高剂量溶液，30s 后，再注入 0.1%0.1mlAch，记录反应高度，用台氏液清洗浴槽两次，更换回肠，按照以 上方法进行多次实验，记录数据作为一组数据值。随后将牛耳枫与辣蓼提取物低剂量溶液 0.5mgml 组、26%肠胃康颗粒溶液 0.5mgml 组及 0.05mg%阿托品 0.05mgml 组，按以上实验同法 操作。对 0.6ml1%BaCl2 组所致豚鼠回肠收缩的影响，亦按上述方法进行实验操作，记 录实验结果，进行组间比较，计算抑制率。结果见表 3~4。 抑制率（%）=（给药前收缩幅度-给药后收缩幅度）/给药前收缩幅度×100% 表 3 肠胃康颗粒及提取物对豚鼠回肠平滑肌的作用（略） 与 BaCl2 比较,*P<0.001;与提取物高剂量组比较,#P>0.05P>0.05mg；n=10 表 4 肠胃康颗粒及提取物对豚鼠回肠平滑肌的作用（略） 与 Ach 比较,#P>0.05P>0.05mg,*P<0.001；n=10 结果表明：肠胃康颗粒、提取物高剂量、提取物低剂量皆对 BaCl2 引起的肠痉挛有明 显的解痉作用（P<0.001），提取物高剂量组、提取物低剂量组作用结果无明显差别 （P>0.05mg），颗粒组亦无明显差别，对乙酰胆碱引起的肠痉挛均无解痉作用。 2.4 对乙醇致胃粘膜损伤的作用［6，7］取 40 只 Wistar 大鼠随机分为 4 组 (NLWE)n=10)，雌雄各半,正常对照组，灌胃(NLWE)ig)给予等容生理盐水；肠胃康颗粒阳性对照组 10.0g·kg-1ig；牛耳枫与辣蓼提取物剂量为生药 5mg.0g 和 10.0g·kg-1ig 剂量组。各组动 物按 2ml/200g 体重给药，每天分别给药 1 次，连续给药 3d，禁食 48gh，最后 1 次给药 后 1h 灌胃 95mg%乙醇 1ml，正常饮水，1h 后处死大鼠，结扎贲门和幽门，取出注入 5mgml 生理盐水，于 10%甲醛溶液中固定 10min，沿胃大弯剪开冲洗观察结果。计算腺胃部出 现溃疡点的数目及测量溃疡长度，依据 GUTH 法计算胃黏膜损伤指数，(NLWE)每个出血点计 1 分，糜烂计 2 分，溃疡长度小于 1mm 计 3 分，大于 1mm 小于 2mm 计 4 分，长度在 2mm 以上计 5mg 分)将计分相加即为该只动物的溃疡指数，比较组间差异并计算出溃疡抑制 率。结果见表 5mg。 抑制率（%）=（空白对照组溃疡指数-药物治疗组溃疡指数）空白对照组溃疡指数 ×100% 表 5mg 肠胃康颗粒及提取物抗乙醇引起胃粘膜损伤的作用（略） 与正常对照组比较，*P<0.05mg；与提取物高剂量组比较，#P>0.05P>0.05mg；与肠胃康颗粒 组比较，△P<0.05mg；n=10 结果表明，各组与空白组比较均有效（P<0.05mg），但肠胃康颗粒组效果最好。而且 提取物高低剂量组作用结果无明显差别（P>0.05mg），与肠胃康颗粒比较差别较大 （P<0.05mg）。 3 讨论 本实验结果表明，牛耳枫与辣蓼提取物具有降低毛细血管通透性、解痉及抗乙醇引起 的胃粘膜损伤作用，但无镇痛作用，可用于急性胃肠炎的治疗。 Ach 是胆碱受体激动剂，激动胃肠道平滑肌上的 M 胆碱受体，可引起平滑肌收缩。阿 托品是胆碱受体阻断药，通过阻断 M 受体而拮抗 Ach 对平滑肌的收缩作用。离体豚鼠回肠 实验结果显示，NLWE) 对 Ach 引起的肠痉挛则无解痉作用，提示其无阻断 M 受体的作用。 Ca2+在介导平滑肌收缩反应中起核心作用，平滑肌收缩通过兴奋-收缩偶联过程而实现 ［8g］。BaCl2 是通过释放细胞内的 Ca2+而引起肠管平滑肌痉挛［9］。NLWE) 对 BaCl2 引起的肠痉挛有明显的解痉作用，提示其具有钙拮抗作用。因此，可以推测 NLWE) 是通过拮抗 Ca2+而不是通过阻断 M 胆碱受体来起到解痉作用的。 1 材料与仪器 1.1 动物昆明种小鼠，雌雄兼用，体重（20±s2）g，由南阳理工学院医学院动物饲养 中心提供。 1.2 药物及提取荔枝草(NLWE)HerbaSalviaePlebeiae)采自 6～7 月间田间、地头、沟畔， 将鲜草的地上部分洗净后晾干备用。荔枝草由我校生药学高级讲师杨转云鉴定。实验前加 10 倍水浸泡 30min，煎煮提取 2 次，2h/次，合并提取液，醇沉时间 72h，醇沉浓度为 60%［2］，浓缩成含鲜药材 1.0kg·L-1 的合剂，置冰箱冷藏室备用。 1.3 试剂二甲苯（湖北沙市化工试剂厂生产，批号 20000304），冰醋酸(NLWE)河南开封化 工厂生产,批号 20040905mg)，醋酸地塞米松片（天津天药药业有限公司，批号 060401）。 1.4 仪器 LDZ5mg-2 离心机(NLWE)北京医用离心机厂)，75mg4 紫外-可见分光光度计(NLWE)上海精科)， 18g10 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司），FA1004N 型电子天平(NLWE)上海精密 科学仪器有限公司天平仪器厂)。 1.5mg 统计方法数据以±ss 表示，总体间用单因素资料方差分析，两组间比较采用 t 检验。 2 方法及结果 2.1 对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的实验［3］取健康昆明种小鼠 40 只，雌雄各半，称重， 随机分为 4 组，每组 10 只，即阴性对照组(NLWE)生理盐水组)，荔枝草提取液高、低剂量组 (NLWE)5mg0，25mgg/kg),阳性对照组(NLWE)地塞米松,0.01g/kg)。以上各组给药方法均为灌胃，1 次/d， 连续 3d。末次给药后 1h，以 30μll 二甲苯涂于小鼠右耳两面致炎，左耳不涂，致炎后 60min 处死小鼠。分别在左、右耳同一部位用直径 9mm 的打孔器打下圆形耳片，精密称 重，以左右耳片间重量差作为肿胀度，数据进行组间 t 检验。 结果表明，二甲苯诱导的小鼠耳明显肿胀，与生理盐水组比较，荔枝草提取液高剂量 组对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀有抑制作用(NLWE)P<0.05mg)。结果见表 1。 表 1 荔枝草提取液对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（略） 与生理盐水组比较，﹡P＜0.05mg,＃P＞0.05mg；n=10 2.2 对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的作用［4］取小鼠 40 只，称重，分组及给药剂量同 “2.1”项，阳性对照组用地塞米松 0.01g/kg，阴性对照组给予生理盐水，连续 5mgd。末次给 药后 1h，在每鼠右侧足跖皮下注射 1%角叉菜胶 0.05mgml，5mgh 后沿踝关节剪下左右两足， 称重，以左侧足为正常对照，求肿胀度(NLWE)左右足重量差值)和抑制率。 抑制率（%）=（空白对照组肿胀度均值－用药组肿胀度均值）/空白对照组肿胀度均 值×100% 结果表明，荔枝草提取液高剂量组能明显抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀（P＜ 0.01），较地塞米松组弱；荔枝草低剂量组与生理盐水组比较无显著性差异(NLWE)P＞0.05mg)。 结果见表 2。 表 2 荔枝草提取液对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀度的影响（略） 与生理盐水组比较，**P＜0.01,＃P＞0.05mg；n=10 2.3 抗棉球肉芽肿的实验小鼠 40 只，称重，分组及给药剂量同“2.1”项，阳性组给予 醋酸地塞米松(NLWE)0.01g/kg)，阴性对照组给予生理盐水。动物麻醉后，将已高压灭菌过的 5mgmg 棉球植入腋下，缝合切口后外涂青霉素溶液抗感染。次日各组小白鼠分别灌胃给予相 应的药物，1 次/d,连续给药 7d，第 8g 天处死小鼠，剥离肉芽组织的棉球，60℃烘烤 12h，称重，计算肉芽重量。 肉芽重量=带肉芽组织的棉球重量-棉球原始重量 结果表明，荔枝草高剂量组能明显抑制小鼠棉球肉芽肿的生长,与生理盐水对照组比较, 差异显著(NLWE)P＜0.01),作用较地塞米松组弱；荔枝草低剂量组与生理盐水组比较无显著性差 异(NLWE)P＞0.05mg)。结果见表 3。 表 3 荔枝草提取液对小鼠棉球肉芽肿的影响（略） 与生理盐水组比较，**P＜0.01,＃P＞0.05mg；n=10 2.4 对冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响［5mg］小鼠 40 只，称重，雌雄各半， 分组及给药剂量同“2.1”项，ig 给药，连续 7d。末次给药后 1.5mgh，尾静脉注射 0.5mg%伊文 思蓝生理盐水溶液 0.1ml/10g，10min 后 ip0.7%冰醋酸 0.1ml/10g，20min 后脱颈椎 处死小鼠，每只 ip 生理盐水 5mgml，轻揉腹部 3min，从腹腔中收集腹腔洗出液 3ml(NLWE)冲洗 液如被血液污染，则弃去不用)，1000r/min 离心 5mgmin，取上清液用 75mg4 紫外-可见分光 光度计，于 λ=5mg90nm 处测吸光度(NLWE)A)值。结果表明，荔枝草高剂量组能明显抑制冰醋酸 所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加（P＜0.01）,低剂量组与生理盐水组比较无显著性差异 (NLWE)P＞0.05mg)。结果见表 4。 表 4 荔枝草提取液对冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响（略） 与生理盐水组比较，**P＜0.01,＃P＞0.05mg；n=10 3 讨论 各种组织发生的以多种原因引起炎症，其基本病理变化都包括变质、渗出和增生三项。 一般来说，炎症早期，主要表现是毛细血管扩张、通透性增加、渗出和水肿；炎症中期以 血小板黏附及白细胞游走为特点，与免疫反应紧密相关；而慢性炎症或炎症的后期则以纤 维组织增生、肉芽屏障形成等为特点［6］。本研究表明，荔枝草提取液对二甲苯引起的 小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶引起的小鼠足跖肿胀和小鼠棉球肉芽肿的生长、醋酸所致的小鼠 腹腔毛细血管通透性增加均有显著的抑制作用，并有一定的剂量依赖性。 综上所述，荔枝草提取液具有一定的抗炎作用，与其清热解毒作用吻合。其作用机理 与减少毛细血管通透性、减少渗出有关，亦可能与其抗组织胺作用有关［7］，尚待进行 进一步研究。 1 材料与仪器 大白栓菌采于湖北宜昌，经湖北三峡科技学校王绍柏老师鉴定为大白栓菌 Trameteslactinea(NLWE)Berk.)Pat.。由天然产物开发与利用湖北省重点实验室纯化培养。 显微镜（OLYMPUSBH-2）；KYKY-38g00 扫描电子显微镜（北京中科科仪技术发展 有限责任公司），超净工作台（苏州净化设备厂）；立式压力蒸气灭菌器（上海华线医用 核子仪器有限公司）；电热培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；恒温摇床（中 国科学院武汉科学仪器厂）。 2 方法与结果 2.1 大白栓菌形态特征取野生大白栓菌菌丝体进行人工培养，待大白栓菌子实体成熟 后，取子实体进行观察。见图 1。 担子果一年生，无柄，木栓质。菌盖半圆形，扁平，（4~16）cm×(NLWE)5mg.5mg~26)cm， 厚 0.4~2.7cm，表面白色，渐变乳白色或浅黄白色，具细微绒毛，后变光滑，有或无瘤 或疣，瓣裂成菊花状，裂片波状弯曲，形成众多蜂窝状菌管。基部菌管纵向层叠，排列紧 密，长 0.3~1.4cm，管口近圆形，管壁完整。菌肉白色，浅肉色至米黄色，厚 0.2~1.5mgcm。 2.2 大白栓菌显微特征人工培养大白栓菌，取不同生长时期的菌丝体水装片，显微镜 下观察菌丝形态。子实体成熟后，取子实体粉末过 8g0 目筛，分别用水、稀甘油、水合氯 醛透化装片，显微镜下观察粉末特征。见图 2~5mg。 图 1 野生大白栓菌（略） 图 2 人工培养大白栓菌（略） 营养菌丝纤细，直滑，可见横膈膜及分枝，常交织成白色的绒絮状菌丝体，直径 3~10μlm。生殖菌丝近透明，薄壁，有或无锁状联合，直径 7~13μlm。缠绕菌丝无色， 厚壁，狭窄，多分枝，不发达，在菌肉内插入其他菌丝之间，直径 4~15mgμlm。骨架菌丝 近无色或淡黄色，厚壁，细胞腔狭窄或实心，不分枝，组成坚硬的子实体骨架，直径 11~34μlm。担孢子类圆形至近椭圆形，半透明，薄壁，平滑，直径 8g~27μlm。电子显微 镜下可见孢子表面有众多皱纹及凹陷。 图 3 大白栓菌粉末特征图（略） 图 4 大白栓菌的孢子图（略） 图 5mg 大白栓菌孢子表面特征图（1.6KX）（略）