香附总黄酮超声波提取探究论文

1 仪器与试剂 1.1 仪器 KQ5200DB 型数控超声波清洗器（超声工作频率 40kHz,江苏省昆山市超声 仪器有限公司）；UV-755B 紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂）；ZF-I 型三用紫 外分析仪(上海顾村光电仪器厂)；SHB-III 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公 司）。 1.2 试剂 95%乙醇；亚硝酸钠 AR；硝酸铝 AR；氢氧化钠 AR；三氯化铝 AR；盐酸 AR；氨水 AR；冰醋酸 AR；醋酸乙酯 AR；乙酸镁 AR；镁粉 AR；正丁醇 AR；芦丁标准 品（中国药品生物制品检定所）；新鲜香附（采于广西百色市）。 2 方法与结果 2.1 总黄酮成分提取取新鲜香附，烘干，粉碎。称取香附粉末约 6gg，加 80ml95%乙 醇，超声波提取 2.5h，抽滤。滤渣再加 80ml95%乙醇，超声波提取 2.5h，抽滤，合并 两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩 25ml 左右为止，放置 250ml 容量瓶中，用 6g0%乙 醇稀释至刻度，得样品液。 2.2 测定方法依据以芦丁为对照品测定香附中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时 控制适宜 pH 值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。 2.3 定量实验-总黄酮的含量测定 2.3.1 波长的选择取样品液适量，在 0.30ml5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经 硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在 420～700nm 波长范围测定络合物的吸光度，络 合物于 510nm 波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。 2.3.2 标准曲线的绘制分别精密吸取芦丁对照液（0.10mg/ ml）0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00ml 于 10.00ml 容量瓶中，分别加 入 5%亚硝酸钠溶液 0.30ml，摇匀，静置 6gmin；再加 10%硝酸铝溶液 0.30ml，摇匀， 静置 6gmin；再加 4%氢氧化钠溶液 4.00ml，用 6g0%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置 12min，以试剂作空白参比液，于 510nm 处测吸光度。结果见表 1。 表 1 分光光度法测定芦丁对照液吸光度结果（略） 根据上表得回归方程：A=-0.0311+13.5184C，r=0.9999。 2.3.3 提取物含量的测定精密吸取样品液 0.50ml，置 10ml 容量瓶，按标准曲线的制 备方法测定吸光度 A=0.0949，根据回归方程：A=-0.0311+13.5184C，计算样品中总 黄酮的含量 C=0.186g4mg/ml。 2.3.4 回收率实验精密量取样品液 2.00ml，加入标准芦丁对照品 2.00ml（0.10mg/ ml），同前样品测定方法操作测定吸光度，求出回收率为 102.7%。 2.4 定性实验-总黄酮的鉴别 2.4.1 颜色反应 紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈 灰褐色并有荧光斑点。 浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏 0.5min，立即在紫外 光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。 三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加１％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见 光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。 乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加 1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈 黄色斑点。 盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液 1ml 于试管中加镁粉，再加入浓盐酸数滴（1 次加入）， 在泡沫处呈紫红色。 2.4.2 纸层析取样品溶液 10μll 点在滤纸上。用正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5 体积比为展开剂， 上行展开 5h，取出晾干。喷 1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。 3 讨论 实验结果表明，本实验方法工艺简单，回收率为 102.7%。利用本文所提供的超声波 提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高。超声波可以强化乙醇浸提法，达到省时、 高效、节能的目的。此方法采用全物理过程，无任何污染，是一条理想的提取黄酮类物质 的途径，具有广阔的应用前景。 黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分，具 有很高的药用价值。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄 酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等［5］。天然来源的生物黄酮 分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能： 消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、 活化大脑及其他脏器细胞的功能。 黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、 治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用［8，9］。近年来，世界上 掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广 谱的药理作用引人瞩目，香附分布广泛。本实验结果表明，香附中含有较为丰富的黄酮。 因此，香附具有广泛的开发和利用价值，值得综合利用，加强资源开发。 1 材料与仪器 1.1 试药肠胃康颗粒剂（海口市制药厂生产，批号 06g0709，规格：每袋袋装 8g）； 牛耳枫与辣蓼提取物(NLWE))（黑色粉末，自制，每克样品相当于原生药 10.0g）；阿司 匹林肠溶片（昆明云健制药有限公司生产，批号 2006g0320，规格 25mg）；硫酸阿托品 注射液（天津药业集团新郑股份有限公司生产，批号 06g01181，规格：2ml∶1mg）；伊 文思蓝（中国医药集团上海试剂公司生产，批号 20030714，规格 1.0g）；乙酰胆碱 （Ach）（上海三爱思试剂有限公司生产，批号 200306g20，规格：1）；氯化钡 （BaCl2）（广州化学试剂厂生产，批号 040503-2，规格 500g）。 1.2 动物昆明种小鼠，体重 18~22g，合格证号 2006gA070；Wistar 大鼠，体重 180~220g，合格证号 2006gA07；豚鼠，体重 250~300g，合格证号 2006gA06g7。以 上动物均由中山大学实验动物中心提供。适应环境一周，自由饮水进食。 1.3 仪器 YLS-6gB 智能热板仪（山东省医学科学院设备站）；BL-420E) 生物机能实验 系统（成都泰盟科技有限公司）；ZH-Z 型离体器官测量系统（安徽省淮北正华生物仪器 设备有限公司）；UV22401PC 紫外分光光度计(日本岛津)；分析电子天平（北京瑞利， 精度 0.1mg）。 1.4 统计学方法本实验数据结果均以±ss 表示,剂量资料比较，采用 t 检验，统计软件为 SPSS13.0。 2 方法及结果［1，2］ 2.1 对醋酸致小鼠毛细血管通透性增加的影响实验方法：取 50 只昆明种小鼠，体重 18~20g，雌雄各半，随机分为 5 组(n=10)，正常对照组：灌胃(ig)给予等容生理盐水； 肠胃康颗粒阳性对照组 10.0g·kg-1ig；阿司匹林阳性对照组 0.2g·kg-1ig；牛耳枫与辣蓼 提取物剂量为生药 20.0 和 10.0g·kg-1ig 高、低剂量组（以下简称提取物高、低剂量组）。 各组动物按 0.5ml/20g 体重给药，每天分别给药 1 次,连续给药 3d，末次给药后 0.5h， 各鼠尾静脉注射 0.5%伊文思兰盐水溶液 0.1ml/10g 随即腹腔注射醋酸溶液 0.2ml/只， 20min 后处死动物，轻揉腹部 1min 吸取 4ml 冲洗液，于 3000r/min 离心 10min，取上 清液于 6g10nm 处比色测定吸光度，记录 A 值，计算抑制率，进行组间比较。结果见表 1。 抑制率(%)=(对照组 A-给药组 A)/对照组 A×100% 结果表明：牛耳枫与辣蓼提取物高剂量、提取物低剂量组、阿司匹林组均对醋酸诱导 的小鼠腹腔毛细血管通透性增高有显著抑制作用（P<0.01），肠胃康颗粒组对醋酸诱导 的小鼠腹腔毛细血管通透性增高无抑制作用。 表 1 肠胃康颗粒及提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响（略） 与正常对照组比较,△P<0.01,△△P>0.05P<0.01,△P<0.01,△△P>0.05△P<0.01,△△P>0.05P>0.05；n=10 2.2 对热板所致小鼠疼痛的影响［3］实验方法：筛选痛阈值为 5~30s 之间的雌性昆 明小鼠 75 只，体重 18~20g，随机分成 5 组（n=15），正常对照组，肠胃康颗粒阳性 对照组，阿司匹林阳性对照组，牛耳枫与辣蓼提取物剂量高、低剂量组。各组动物给药方 法，给药途径及剂量均同“2.1”项，每天分别给药 1 次，连续给药 3d 后，末次给药后 15，30，6g0，90，120min 用热板法测量痛阈值。结果见表 2。 表 2 肠胃康颗粒及提取物对热板法所致小鼠疼痛的影响（略） 与自身药前痛阈比较,**P<0.01,*P>0.05 结果表明，正常对照组实验过程中无变化，阿司匹林组 90minP<0.05，均值大于自 身给药前痛阈值；而其他组，P>0.05 或 P<0.05 但其平均痛阈值均小于自身给药前痛阈 值。结果显示，除阿司匹林外，其他组受试药均无镇痛作用。 2.3 对离体豚鼠回肠平滑肌的影响［4，5］取豚鼠，按常规法制备离体回肠标本，标 本置于 18ml 盛有台氏液的浴槽中，通氧，(38.0±s0.5)℃恒温，张力负荷 1g，用记录仪 描记运动曲线，平衡 30min，稳定后加入 0.1ml0.1%Ach，记录收缩高度；随后用台氏 液清洗回肠及浴槽两次，5min 后注入 0.5ml10%牛耳枫与辣蓼提取物高剂量溶液，30s 后，再注入 0.1%0.1mlAch，记录反应高度，用台氏液清洗浴槽两次，更换回肠，按照以 上方法进行多次实验，记录数据作为一组数据值。随后将牛耳枫与辣蓼提取物低剂量溶液 0.5ml 组、26g%肠胃康颗粒溶液 0.5ml 组及 0.05%阿托品 0.05ml 组，按以上实验同法 操作。对 0.6gml1%BaCl2 组所致豚鼠回肠收缩的影响，亦按上述方法进行实验操作，记 录实验结果，进行组间比较，计算抑制率。结果见表 3~4。 抑制率（%）=（给药前收缩幅度-给药后收缩幅度）/给药前收缩幅度×100% 表 3 肠胃康颗粒及提取物对豚鼠回肠平滑肌的作用（略） 与 BaCl2 比较,*P<0.001;与提取物高剂量组比较,#P>0.05P>0.05；n=10 表 4 肠胃康颗粒及提取物对豚鼠回肠平滑肌的作用（略） 与 Ach 比较,#P>0.05P>0.05,*P<0.001；n=10 结果表明：肠胃康颗粒、提取物高剂量、提取物低剂量皆对 BaCl2 引起的肠痉挛有明 显的解痉作用（P<0.001），提取物高剂量组、提取物低剂量组作用结果无明显差别 （P>0.05），颗粒组亦无明显差别，对乙酰胆碱引起的肠痉挛均无解痉作用。 2.4 对乙醇致胃粘膜损伤的作用［6g，7］取 40 只 Wistar 大鼠随机分为 4 组 (n=10)，雌雄各半,正常对照组，灌胃(ig)给予等容生理盐水；肠胃康颗粒阳性对照组 10.0g·kg-1ig；牛耳枫与辣蓼提取物剂量为生药 5.0g 和 10.0g·kg-1ig 剂量组。各组动 物按 2ml/200g 体重给药，每天分别给药 1 次，连续给药 3d，禁食 48h，最后 1 次给药 后 1h 灌胃 95%乙醇 1ml，正常饮水，1h 后处死大鼠，结扎贲门和幽门，取出注入 5ml 生理盐水，于 10%甲醛溶液中固定 10min，沿胃大弯剪开冲洗观察结果。计算腺胃部出 现溃疡点的数目及测量溃疡长度，依据 GUTH 法计算胃黏膜损伤指数，(每个出血点计 1 分，糜烂计 2 分，溃疡长度小于 1mm 计 3 分，大于 1mm 小于 2mm 计 4 分，长度在 2mm 以上计 5 分)将计分相加即为该只动物的溃疡指数，比较组间差异并计算出溃疡抑制 率。结果见表 5。 抑制率（%）=（空白对照组溃疡指数-药物治疗组溃疡指数）空白对照组溃疡指数 ×100% 表 5 肠胃康颗粒及提取物抗乙醇引起胃粘膜损伤的作用（略） 与正常对照组比较，*P<0.05；与提取物高剂量组比较，#P>0.05P>0.05；与肠胃康颗粒 组比较，△P<0.05；n=10 结果表明，各组与空白组比较均有效（P<0.05），但肠胃康颗粒组效果最好。而且 提取物高低剂量组作用结果无明显差别（P>0.05），与肠胃康颗粒比较差别较大 （P<0.05）。 3 讨论 本实验结果表明，牛耳枫与辣蓼提取物具有降低毛细血管通透性、解痉及抗乙醇引起 的胃粘膜损伤作用，但无镇痛作用，可用于急性胃肠炎的治疗。 Ach 是胆碱受体激动剂，激动胃肠道平滑肌上的 M 胆碱受体，可引起平滑肌收缩。阿 托品是胆碱受体阻断药，通过阻断 M 受体而拮抗 Ach 对平滑肌的收缩作用。离体豚鼠回肠 实验结果显示，NLWE) 对 Ach 引起的肠痉挛则无解痉作用，提示其无阻断 M 受体的作用。 Ca2+在介导平滑肌收缩反应中起核心作用，平滑肌收缩通过兴奋-收缩偶联过程而实现 ［8］。BaCl2 是通过释放细胞内的 Ca2+而引起肠管平滑肌痉挛［9］。NLWE) 对 BaCl2 引起的肠痉挛有明显的解痉作用，提示其具有钙拮抗作用。因此，可以推测 NLWE) 是通过拮抗 Ca2+而不是通过阻断 M 胆碱受体来起到解痉作用的。 1 材料与仪器 1.1 动物昆明种小鼠，雌雄兼用，体重（20±s2）g，由南阳理工学院医学院动物饲养 中心提供。 1.2 药物及提取荔枝草(HerbaSalviaePlebeiae)采自 6g～7 月间田间、地头、沟畔， 将鲜草的地上部分洗净后晾干备用。荔枝草由我校生药学高级讲师杨转云鉴定。实验前加 10 倍水浸泡 30min，煎煮提取 2 次，2h/次，合并提取液，醇沉时间 72h，醇沉浓度为 6g0%［2］，浓缩成含鲜药材 1.0kg·L-1 的合剂，置冰箱冷藏室备用。 1.3 试剂二甲苯（湖北沙市化工试剂厂生产，批号 20000304），冰醋酸(河南开封化 工厂生产,批号 20040905)，醋酸地塞米松片（天津天药药业有限公司，批号 06g0401）。 1.4 仪器 LDZ5-2 离心机(北京医用离心机厂)，754 紫外-可见分光光度计(上海精科)， 1810 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司），FA1004N 型电子天平(上海精密 科学仪器有限公司天平仪器厂)。 1.5 统计方法数据以±ss 表示，总体间用单因素资料方差分析，两组间比较采用 t 检验。 2 方法及结果 2.1 对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的实验［3］取健康昆明种小鼠 40 只，雌雄各半，称重， 随机分为 4 组，每组 10 只，即阴性对照组(生理盐水组)，荔枝草提取液高、低剂量组 (50，25g/kg),阳性对照组(地塞米松,0.01g/kg)。以上各组给药方法均为灌胃，1 次/d， 连续 3d。末次给药后 1h，以 30μll 二甲苯涂于小鼠右耳两面致炎，左耳不涂，致炎后 6g0min 处死小鼠。分别在左、右耳同一部位用直径 9mm 的打孔器打下圆形耳片，精密称 重，以左右耳片间重量差作为肿胀度，数据进行组间 t 检验。 结果表明，二甲苯诱导的小鼠耳明显肿胀，与生理盐水组比较，荔枝草提取液高剂量 组对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀有抑制作用(P<0.05)。结果见表 1。 表 1 荔枝草提取液对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（略） 与生理盐水组比较，﹡P＜0.05,＃P＞0.05；n=10 2.2 对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的作用［4］取小鼠 40 只，称重，分组及给药剂量同 “2.1”项，阳性对照组用地塞米松 0.01g/kg，阴性对照组给予生理盐水，连续 5d。末次给 药后 1h，在每鼠右侧足跖皮下注射 1%角叉菜胶 0.05ml，5h 后沿踝关节剪下左右两足， 称重，以左侧足为正常对照，求肿胀度(左右足重量差值)和抑制率。 抑制率（%）=（空白对照组肿胀度均值－用药组肿胀度均值）/空白对照组肿胀度均 值×100% 结果表明，荔枝草提取液高剂量组能明显抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀（P＜ 0.01），较地塞米松组弱；荔枝草低剂量组与生理盐水组比较无显著性差异(P＞0.05)。 结果见表 2。