安痛藤化学成分探究论文

1 材料与方法 1.1 仪器与材料 X-4A 数字显微熔点测定仪(温度未校正)、DU-650 型紫外分光光度计（美国 Beckman 公司）、Agilent1100 型高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司）、FT-IR2000 型红外分光光度计（美国 Perkin-Elmer 公司）、Mercuryplus400MHz 核磁共振仪(美 国 varian 公司)、Q-TofmicoYA019 质谱仪(英国质谱公司)，硅胶均为青岛海洋化工厂产 品,柱层析用聚酰胺为浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂,所用试剂均为分析纯。安痛藤采 于江西赣南地区，由江西中医学院刘庆华老师采集并鉴定为葡萄科植物苦朗藤 Cissusassamica(Laws.) 1.2 提取与分离 取安痛藤粗粉,用 80%乙醇渗漉至近无色。回收乙醇后加适量水混悬，依次用氯仿， 醋酸乙酯，正丁醇萃取，各萃取部分均用真空浓缩。取醋酸乙酯萃取部分，上聚酰胺柱。 用水洗至无色，浓缩得到水洗浓缩液 A,聚酰胺柱再用 95%乙醇洗脱至无成分流出，洗脱 液浓缩，得浓缩液 B。浓缩液 A 经硅胶柱分离，以氯仿∶乙醇（5∶2）洗脱得化合物Ⅰ。浓 缩液 B,经硅胶柱分离，以氯仿∶甲醇（80∶20-0∶1）梯度洗脱，得到结晶Ⅱ～Ⅴ。Ⅱ～Ⅴ。 2 结果 2.1 结晶Ⅱ～Ⅴ。Ⅰ 无色棱柱状结晶Ⅱ～Ⅴ。（MeOH），mp134～136℃。可溶于甲醇和热水。异羟肟铁反应 阳性，三氯化铁/铁氰化钾反应显蓝色。UVλmax(nm)λmax(nm)max(nm)：275，220。TOFMSm/ z:327.08(M-H),TOFMSMS327.08m/z:327.08(M-H,11%)，312.07(M-HCH3,70%)，234.06(M-H-CH3-C2H6O3，90%)，192.04(M-H-CH3C4H8O4,100%)；ＩＲ υmaxcm-1:3389.96maxcm-1:3389.96，3251.68(-OH)，2951.87(CH3)，2892.28(CH2-)，1704.38(C=O)，1612.27，1528.64，1464.03(aromatic)，1343.83，12 34.90(aromaticC-0)，861.20(C-H)；1HNMR(TMS，C5D5N,400MHz)δ:3.99(s,3H,-OCH3)，4.174.33(m,3H)，4.5(dd,j=8.6,9.0，1H)，4.65(t,j=9.78,1H)，4.72(d,j=10.56,1H)， 5.27(d,j=10.57,1H)，7.6(s,1H,aromatic-H)；13CNMR(TMS，C5D5N,400MHz)δ:119.528(C1)，116.579(C2)，149.402(C3)，141. 894(C4)，152.769(C5)，111.073(C6)，165.454(C7)，73.876(C1 ＇)，75.522(C2＇)，81.297(C3＇)，72.089(C4＇)，83.501(C5＇)，62.575(C6 ＇)，60.283(MeO)。以上数据与文献［2，3］报道一致，结晶Ⅱ～Ⅴ。Ⅰ与岩白菜素对照品，在 TLC 和 HPLC 多种溶剂系统中，Rf 值完全一致，保留时间一致，与岩白菜素对照品混合熔 点不降低,故推定为岩白菜素（bergenin）。 2.2 结晶Ⅱ～Ⅴ。Ⅱ 淡黄粒状结晶Ⅱ～Ⅴ。（氯仿+甲醇），mp259～261℃。TOFMSm/z:343.02(MH),TOFMSMS343.02m/z:328.02（M-H-CH3，100%），312.99（M-HOCH3，90%）；1H-NMR(TMS，C5D5N，400MHz)δ:3.88（s，3H，4＇OCH3）,4.17（s，3H，3＇-OCH3）,4.23（s，3H，3- OCH3）,7.85(s,1H,aromatic-H)，8.07(s,1H,aromatic-H);13CNMR(TMS，C5D5N,400MHz)δ:56.604（4＇-OCH3）,61.36（3＇OCH3）,61.592（3-OCH3）,108.065（C-5）,111.864（C-5＇）,112.883（C4）,113.144（C-4＇）,113.885（C-3）,114.333（C-3＇）,141.37（C6）,141.778（C-6＇）,141.993（C-1）,142.388（C-1＇）,154.34（C2）,154.556（C-2＇）,159.207(C=O),159.307(C=O)。以上数据与文献［4，5］报 道基本一致，故推定为 3,3＇,4＇-三甲氧基鞣花酸（3,3＇,4＇-tri-Omethylellagicacid）。 2.3 结晶Ⅱ～Ⅴ。Ⅲ 白色针状结晶Ⅱ～Ⅴ。（石油醚+丙酮），mp139～141℃。TOFMSm/z:397.42（M+HH2O），TOFMSMS397.30m/z:397.31(M+HH2O，40%),189.08(27%)，175.06(39%)，161.04(78%)，147.02（100%）； 1H-NMR(TMS，CDCl3，400MHz)δ：3.56(1H，m，H3α)，5.35(1H，br.d，J=5.09Hz，H-6)，0.6746(3H，t，J=7.43Hz，H29)，0.835(3H，d，J=10.95Hz，H-26)，0.803(3H，d，J=10.96Hz，H27)，0.916(3H，d，J=6.26Hz，H-21)，1.004(3H，s，H-18)，1.565(3H，s，H19)；13C-NMR(TMS，CDCl3,400MHz)δ:37.216(C-1)，31.63(C-2)，71.799(C3)，42.266(C-4)，140.726(C-5)，121.728(C-6)，31.864(C-7)，31.864(C8)，50.077(C-9)，36.478(C-10)，21.055(C-11)，39.732(C-12)，45.779(C13)，56.728(C-14)，24.286(C-15)，28.238(C-16)，55.998(C-17)，11.965(C18)，19.392(C-19)，36.128(C-20)，18.999(C-21)，33.897(C-22)，29.078(C23)，51.216(C-24)，25.977(C-25)，18.757(C-26)，19.82(C-27)，23.019(C28)，11.844(C-29)。以上数据与文献［6，7］报道基本一致，结晶Ⅱ～Ⅴ。Ⅲ与 β-Sitosterol 对照品，在 TLC 多种溶剂系统中的 Rf 值完全一致，与 β-Sitosterol 对照品混合熔点不降 低,故推定为 β-谷甾醇（β-Sitosterol）。 2.4 结晶Ⅱ～Ⅴ。Ⅳ 白色粉末（乙醇），mp242℃～244℃。Molish 反应阳性，茴香醛-浓硫酸反应显橙 红色，NaOH 试液反应显黄色，FeCl3 溶液反应显浅蓝色。取化合物Ⅳ与没食子酸对照品 进行红外光谱比较，吸收峰位置与强度基本一致，故可确定化合物Ⅳ为没食子酸 (Gallicacid)。 2.5 结晶Ⅱ～Ⅴ。Ⅴ 淡黄粉末（甲醇），mp263～265℃。TOFMSm/z:329.06（MH），TOFMSMS329.06m/z:314.05（M-H-CH3，100%），299.03（M-HOCH3，80%）；1H-NMR(TMS，C5D5N，400MHz)δ:8.085（s，2H，aromaticH）,4.22（s，3H，3''''-OCH3）,4.21（s，3H，3-OCH3）；13CNMR(TMS，C5D5N,400MHz)δ:112.906(C-1,1＇)，142.135(C-2,2 ＇)，153.833(C-3,3＇)，141.4(C-4,4＇)，110.365(C-5,5＇)，113.474(C-6,6 ＇)，159.415(C-7,7＇)，61.331(-OCH3)。以上数据与文献［8，9］报道基本一致， 故推定为 3,3＇-二甲氧基鞣花酸（3,3＇-di-O-methylellagicacid）。 3 讨论 安痛藤味辛，性平，有着悠久的药用历史，在多部本草著作中均有记载。本实验所分 离的岩白菜素，3,3＇,4＇-三甲氧基鞣花酸，3,3＇-二甲氧基鞣花酸均为首次从该植物中 提取得到，其中 3,3＇-二甲氧基鞣花酸与 3,3＇,4＇-三甲氧基鞣花酸为首次从该属植物中 得到。文献［10］记载，岩白菜素具有止咳祛痰，抗炎、护肝、抗溃疡、提高免疫等作用。 β-谷甾醇具有降低胆固醇、止咳、抗癌及抗炎等作用，临床治疗慢性气管炎，有效率达 89.3%［11］。 本研究结果为安痛藤的药效研究提供了基础资料,为安痛藤资源进一步深度开发和合理 利用提供科学依据。安痛藤其它提取部分的成分将继续进行分离鉴定，其生物活性还有待 于进一步实验。 1 牛黄的性状鉴别 1.1 天然牛黄的性状鉴别天然牛黄来源于牛科动物牛 BostaurusdomesticusGmelin 干燥的胆结石。主产于华北、东北、西北等地。分别称京牛黄、东牛黄、西牛黄。取自胆 囊的牛黄习称“胆黄”。取自胆管或者肝管的牛黄习称“管黄”。由于宰杀牛后未检查,牛黄在 胆囊内的时间过长,胆汁渗入黄内而成习称“吃胆牛黄”。 1.1.1 胆黄形状：多呈卵形,不规则形,三角形或四方形。大小不一,直径 0.6～ 3.3cm；表面：黄红色或棕黄色,细腻而稍有光泽,有的外部挂有一层黑色光亮的薄膜,习称 “乌金衣”。有的粗糙具疣状突起。有的具有裂纹；质地：体轻,质松脆易碎；断面：金黄色, 有排列整齐的同心层纹；气味：气清香,味先苦而后微甜,入口有清凉窜透感,嚼之不粘牙。 1.1.2 管黄形状：多呈短管状,长约 3cm,直径 0.5～1.5cm；表面：红棕或黄棕色,有 的呈棕褐色,表面不平或有横曲纹,有裂纹及小突起；断面：断面有较少的层纹,有的中空,色 较深；气味：同胆黄。 1.1.3 胆牛黄多成暗红棕色或者黑色。质较硬，不松脆，断面似胶状，显黑色或者墨 绿色，同心性层纹不明显或隐约可见。无清香气，味苦。 1.2 人工培植牛黄的性状鉴别由于牛黄产量稀少,近年来河北等省,生产人工培植牛黄。 销于全国并出口。人工培植牛黄是在牛胆囊内,放置异物,再注入易感菌,促使胆囊发炎,造成 病理变化而促使胆结石形成。现又用注射法和用人工模拟胆囊和体外循环等新技术，在牛 体内进行培育牛黄的研究,克服了手术育黄的弊端。其主要成分、药理作用和功能主治与牛 黄基本相同。 药材为不规则的块状或粉未。棕黄色或黄褐色。质较疏松,间有少量的灰白色疏松状物 和乌黑硬块。气微腥,味微苦而后甜,有清凉感。本品与牛黄碎片相似,不同点是断面不具有 同心层纹。 1.3 人工合成牛黄的性状鉴别人工合成牛黄是自牛或猪等的胆汁中提取成分,参照天然 牛黄的已知成分配制而成。多数成粉状,也有成不规则的球块。浅棕黄色或金黄色。质轻松。 气微清香而略腥,味微甜而苦,入口无清凉感。水溶液也能“挂甲”,可作天然牛黄的代用品。 已大量应用于临床。 以上牛黄均属正品牛黄,只是质量不同,疗效有差异。但都能应用于临床。牛黄为贵重 药材,在商品中发现伪品的牛黄不少,如用黄连、大黄、黄柏、姜黄、鸡蛋黄等的粉未加工, 或加少量牛黄伪造。这些伪品使用显微鉴别和理化鉴别都不难分辨。 2 牛黄的显微鉴别 牛黄正品及常见掺伪品显微鉴别的比较。见表 1。 表 1 牛黄与常见掺伪品的显微特征比较（略） 3 牛黄的理化鉴别 3.1 颜色反应取少许置试管中,分别加下列试剂 3mL 微热,有显色反应：加冰醋酸显绿 色,冷后小心滴加等容积的硫酸,下层无色,上层绿色,两层相接处显红色环（甾类反应)。加 硫酸显绿色;加硝酸显红色;加氨水显黄褐色(胆红素)。 3.2 沉淀反应取粉末 0.1g,加盐酸 1ml 及氯仿 10ml,充分振摇,混匀,氯仿层呈黄褐色, 分取氯仿层,加氢氧化钡试液 5ml,振摇,即生成黄褐色沉淀(胆红素反应),分离除去水层和沉 淀,取氯仿层约 1ml、加醋酐 1ml,硫酸 2 滴,摇匀,放置,溶液呈绿色(检查胆固醇) 3.3 红外线吸收光谱取粉末少许,夹于溴化钾片之间,测定红外光谱。不同来源的正品牛 黄的图谱基本相似,在 745～755，980～990，1240～1250，1565～1570，1620～ 1630cm-1 和 1655～1665cm-1 处均有明显的吸收峰。人工牛黄、伪品牛黄的图谱与天 然牛黄有明显差别。 4 牛黄的经验鉴别 4.1 染甲法取牛黄少量加清水调和，涂于指甲上，能将指甲染成黄色，擦抹后，指甲 有明亮的黄色，经久不退，习称“挂甲”。 4.2 水检法用无色透明的杯子装半杯清水，投入牛黄少许，牛黄吸水变湿而不变形。 4.3 水煮法取牛黄少许加水煮沸，全部溶化，水质色黄清亮者为正品，若入水后迅速 膨胀而崩解者或水质混浊或有沉淀或有漂浮物出现者则为伪品。 4.4 口尝法用舌尖舔牛黄，味先苦而后转甜，有清凉感直达舌根及喉部，同时无杂味 及臭味，若入口纯苦而不转甜，无清凉感，且有它味或腥臭者则为伪品。 4.5 针刺法取针烧红，刺入牛黄中，其分列成层状，质细密酥脆，有时内有白点，气 清香。 5 讨论 由于牛黄药源短缺，价格昂贵，疗效显著，造假、掺假十分严重。通过掌握以上性状 鉴别，显微鉴别，理化鉴别，经验鉴别就能很好的识别真假，有效地控制临床用药质量和 安全有效。 【关键词】牛黄正品伪品鉴别 1 药品与试剂 薄荷脑,欧前胡素,甘草次酸,均购自中国药品生物制品检定所；薄荷 MenthahaplocalyxBriq.；白芷 Angelicadahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.；甘草 GlycyrrhizauralensisFisch.；以上药材均为市售；鼻炎舒水由大连医科大学附属一院提 供（批号 20040212，20040305，20040408）规格为 5ml/支，每毫升含生药 1g；硅 胶 G，青岛海洋化工厂出品；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，上海化学试剂公司产品。所用 试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 薄荷的薄层色谱鉴别［1］ 2.1.1 对照品溶液的配制精密称取薄荷脑标准品，加石油醚制成每毫升含 2mg 的溶液， 作为对照品溶液。 2.1.2 供试样品溶液的配制取本品 10ml,加石油醚 10ml，置水浴中加热回流 30min，分取石油醚层作为供试品溶液。 2.1.3 阴性对照溶液的制备将处方中薄荷除去，按本品制备工艺及供试品溶液制备方 法，制成阴性对照溶液，装瓶备用。 2.1.4 鉴别方法用微量注射器分别精密吸取供试样品溶液 10，15μll，对照品溶液 10μll，阴性对照溶液 10μll，分别点于同一硅胶 G-CMC-Na 板上，以苯-醋酸乙酯（17： 3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5%香草醛硫酸溶液，在 105℃烘至斑点显色清 晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无此斑 点。结果见图 1。 2.2 白芷的薄层色谱鉴别［1］ 2.2.1 对照品溶液的配制精密称取欧前胡素标准品，加醋酸乙酯制成每毫升含 1mg 的 溶液，作为对照品溶液。 2.2.2 供试样品溶液的配制取本品 5ml，加乙醚提取两次，10ml/次，合并提取液， 挥干乙醚，残渣加醋酸乙酯 1ml 溶解，作为供试品溶液。 2.2.3 阴性对照溶液的制备将处方中白芷除去，按本品制备工艺及供试品溶液制备方 法，制成阴性对照溶液，装瓶，备用。 2.2.4 鉴别方法用微量注射器分别精密吸取供试样品溶液 10，15μll，对照品溶液 10μll，阴性对照溶液 10μll，分别点于同一硅胶 G-CMC-Na 薄层板上，以石油醚-乙醚 (3∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与 对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无此斑点。结果见图 2。 2.3 甘草的薄层色谱鉴别［1］ 2.3.1 对照品溶液的配制精密称取甘草次酸标准品，加无水乙醇制成每毫升含 1mg 的 溶液，作为对照品溶液。 2.3.2 供试样品溶液的配制取本品 5ml，置圆底烧瓶中，加 2mol/L 盐酸 50ml，加热 水解 1h，放冷，加乙醚提取 2 次，15ml/次，合并乙醚液，蒸干，残渣加无水乙醇 3ml 溶解，加 0.02g 活性炭搅拌，滤过，取滤液作为供试品溶液。 2.3.3 阴性对照溶液的制备将处方中甘草除去，按本品制备工艺及供试品溶液制备方 法，制成阴性对照溶液，装瓶，备用。 2.3.4 鉴别方法用微量注射器分别精密吸取供试品溶液 10，15μll，对照品溶液 10μll，阴性对照品溶液 10μll 分别点于同一硅胶 GF254 薄层板上，以石油醚-苯-醋酸乙酯-