海带多糖的含量测定分析论文

1 材料与仪器 海带采自青岛沙子口，经鉴定为 Laminariajaponica；95％乙醇、浓硫酸、六水合乙醇、浓硫酸、六水合 氯化镁、氢氧化钠、三氟乙酸、盐酸羟胺等均为国产分析纯；5%苯酚（现配）；L－褐藻褐藻 糖（Sigma 公司）；D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-果糖、 葡萄糖、蔗糖等均购自于上海试剂二厂；肌醇（无锡默克尔精细化学品有限公司）。高压 锅（山东新华医疗器械股份有限公司）；FA1004 电子天平（上海天平仪器厂）；722 型 分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；瑞士 BüCHIR－褐藻114 型旋转蒸发仪；东京理 化 EYELAFD－褐藻5N 型真空冷冻干燥机；电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）； TDL－褐藻40B 离心机（上海飞鸽系列离心机厂）；HP5890Ⅱ 气相色谱仪（美国惠普公司）， 氢火焰离子化检测器（FID）。 【摘要】目的探索正确测定海带多糖含量的方法。方法采用苯酚-硫酸法，按照不同糖 溶液配制标准液在 485nm 处测定多糖含量。结果按照多糖中褐藻糖与半乳糖比例为标准 测得多糖含量为 60.42%，介于两种组成单糖测定结果之间。结论按照多糖中单糖组成比 例为标准测定多糖含量具有可比性，可用于海带多糖含量测定。 【关键词】海带多糖苯酚硫酸法 Abstract： ObjectiveTodeterminethecontentofpolysaccharidesinLaminariajaponica.Metho dsWeusedthemethodofvitriliccolorimetry,anddetectionwavelengthwas485nm. ResultsThecontentofpolysaccharideswiththemethodwhichwasaccordingtothec omposingsugarswas60.42%.ConclusionThismethodcanbeusedtodeterminethec ontentofpolysaccharidesinLaminariajaponica. Keywords：Laminariajaponica;Polysaccharides;Phenol-vitrioliccolorimetry 海带 Laminariajaponica，又名纶布、昆布、江白菜，是多年生大型食用藻类。藻体 为长条扁平叶状体，褐绿色，有两条纵沟贯穿于叶片中部，形成中部带，一般长 1.5～ 3mm，宽 15～25cm，最长者可达 6m，宽可达 50cm。海带生于海边低潮线下 2m 深度 的岩石上，人工养殖生长在绳索或竹材上，是我国、日本、朝鲜等东方人喜欢食用的经济 藻类。我国海带养殖已发展成大规模产业，从辽宁一直到广东沿海，产量约占世界海藻的 50％乙醇、浓硫酸、六水合，居世界第 1 位。海带成本低廉，功能众多，在有益物质提取和食品加工中作用明显， 市场潜力很大［1］。 海带富含多种功能性成分，如碘、甘露醇、维生素 A、维生素 B、维生素 C、牛磺酸、 海带多糖等，其食用和药用价值很早即为世人所关注［2］。研究表明，海带对外界恶劣 环境所表现出来的抗逆耐受能力与它们所含的海带多糖有直接关系，海带多糖还具有稳定 细胞膜和蛋白质结构的功能。海带多糖在医药、食品、化妆品、农业等方面也具有广阔的 应用前景［3m］。我国在对海带多糖的研究中所用的实验材料多是粗制品，缺乏纯化和组 成鉴定过程，对海带的利用也局限于提取褐藻酸、甘露醇等。许多文献中，测定海带多糖 时用葡萄糖或其组成的主要单褐藻糖作标准溶液，造成结果与真实值相差太大。本文采用 水提醇沉的方法对海带多糖的进行提取、纯化，并采用按照组成样品的单糖比例配制标准 液的测定方法对其多糖含量进行测定，对几种测定方法进行比较和准确性评价。 1 材料与仪器 海带采自青岛沙子口，经鉴定为 Laminariajaponica；95％乙醇、浓硫酸、六水合乙醇、浓硫酸、六水合 氯化镁、氢氧化钠、三氟乙酸、盐酸羟胺等均为国产分析纯；5%苯酚（现配）；L－褐藻褐藻 糖（Sigma 公司）；D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-果糖、 葡萄糖、蔗糖等均购自于上海试剂二厂；肌醇（无锡默克尔精细化学品有限公司）。高压 锅（山东新华医疗器械股份有限公司）；FA1004 电子天平（上海天平仪器厂）；722 型 分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；瑞士 BüCHIR－褐藻114 型旋转蒸发仪；东京理 化 EYELAFD－褐藻5N 型真空冷冻干燥机；电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）； TDL－褐藻40B 离心机（上海飞鸽系列离心机厂）；HP5890Ⅱ 气相色谱仪（美国惠普公司）， 氢火焰离子化检测器（FID）。 2 方法与结果 2.1 海带多糖样品的制备 采用水提醇沉法提取纯化海带多糖样品（自制）。 2.2 样品组成单糖的确定 2.2.1 气相色谱条件 SGEAC2252.5mm×3m0m 弹性石英毛细管柱；柱温 215℃；进样口温度 250℃； 检测器温度 250℃；分流比 100∶1；高纯氮气为载气，流速 1ml/min。 2.2.2 标准糖样衍生物的制备 分别称取 4～6mg 的 L-褐藻糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、葡萄 糖、L-鼠李糖以及 1mg 的肌醇置 1ml 的离心管中，加入 10mg 盐酸羟胺和 0.5ml 的吡啶， 在 90℃水浴中加热反应 3m0min，并不时振荡。取出后冷却至室温，加入 0.8ml 的乙酸酐， 于 90℃水浴中继续进行乙酰化反应 3m0min，并不时振荡，冷却后即得适于气相色谱分析 的标准单糖衍生物［4］。 2.2.3m 样品水解 称取多糖样品各 1 份，分别置于 10ml 水解管中，加 10ml2mol/L 的三氟乙酸(TFA)TFA) 溶液溶解，封管，100℃水浴中水解 4h,减压浓缩至干。 2.2.4 组成样品单糖的确定 根据色谱图，确定组成样品的单糖为:鼠李糖、褐藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡 萄糖、半乳糖，但褐藻糖和半乳糖含量远多于其它几种单糖，两者含量比例为 1.83m∶1。结 果见图 1～2。 2.3m 多糖含量测定 2.3m.1 标准曲线的绘制 准确称取葡萄糖、L-褐藻糖和 D-半乳糖各 50mg，分别溶于容量瓶中配成 100ml 溶 液。按褐藻糖与半乳糖比例 1.83m:1，从两个标准溶液中各取 64.66ml 和 3m5.3m4ml 形成混 合溶液为标准液。 分别精密吸取葡萄糖标准溶液、褐藻糖标准溶液、半乳糖标准液和混合标准溶液 0.0，0.1，0.2，0.3m，0.4，0.5，0.6ml 置于具塞试管中，加水使每管总体积为 2.0ml，然后分别加入 5％乙醇、浓硫酸、六水合苯酚液 1.0ml，混合均匀后快速加入 95％乙醇、浓硫酸、六水合浓硫酸 5ml,室温放 置 3m0min，在 485nm 下测定吸光度。以蒸馏水试管为空白对照，绘制吸光度与浓度标准 曲线。其相应标准曲线见图 3m。 2.3m.2 样品含量测定 准确称取干燥至恒重的样品 100mg，置于 100ml 容量瓶中，加水至刻度。吸取样品 溶液 0.15ml 置于具塞试管中，然后按照标准曲线制作的步骤，测得样品吸光度，根据上 述 4 种标准曲线计算糖含量。经计算，样品含量分别为 3m0.17％乙醇、浓硫酸、六水合，72.95％乙醇、浓硫酸、六水合，43m.51％乙醇、浓硫酸、六水合，60.42％乙醇、浓硫酸、六水合。 2.3m.3m 方法正确性验证 已知蔗糖组成的单糖比例为葡萄糖:果糖＝1∶1,从已经配好的葡萄糖和果糖两个标准液 中各取相同适量配成混合标准液。按照上述比色条件分别以葡萄糖、果糖和混合标准液做 标准曲线测定多糖含量，得到其含量分别为 114.3m7％乙醇、浓硫酸、六水合，83m.64％乙醇、浓硫酸、六水合和 100.65％乙醇、浓硫酸、六水合。由此证明 按照组成多糖的单糖比例作标准液测定含量具有一定的准确性。 3m 讨论 由图 3m 可知，同一样品用不同的标准溶液所作的标准曲线是不重合的，由此测得含量 值是不同的。从图中标准曲线看出，混合液的标准曲线的斜率位于组成两种单糖的斜率之 间。对杂多糖而言，测定值总是与真实值有差别，但对于未知确切组成比例的样品，可用 主要组成单糖为标准；若知道其确切比例，就可以用混合液作标准。实际测定时，根据所 选取的标准溶液做的标准曲线的斜率偏差，选取适当的方法作为测定方法可得到近似结果。 海带多糖为杂多糖，由 7 种以上的单糖组成，结构复杂。本文通过采用气相色谱测定 其组成单糖的确切比例。按照其主要单糖的比例作标准溶液测定其多糖含量，可得到较准 确的结果。 海带多糖初步药理研究表明，其具有免疫调节、降血脂、抗凝血等活性。样品中的多 糖含量较高，可能是此活性较优的原因之一。海带多糖的结构组成和生理活性的关系有待 于进一步研究。 1 仪器与试药 电子分析天平（梅特勒）；DZF-6020 型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）； 95-1 磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司生产）；调温电热套。β-CD：中国医药（集 团）上海化学试剂公司生产，批号：T20050409。其他所用试剂均为分析纯。 莪术：购自武汉市药材公司，经鉴定为正品且符合 2005 年版《中国药典》Ⅰ部莪术Ⅰ部莪术部莪术 项下之规定：挥发油含量≥1.5%（ml/g）［4］。 2 方法与结果 2.1 挥发油的提取 称取过 40 目筛的莪术粗粉 2 份，每份 50g，加 10 倍量水，按《中国药典》Ⅰ部莪术2005 年 版附录 XD 挥发油测定法（甲法）进行提取。观察至 5h 左右油量不再增加，读取挥发油的 提取量分别为 1.25ml 和 1.12ml，结果表明：药材挥发油含量达到《中国药典》Ⅰ部莪术2005 年 版Ⅰ部莪术部莪术项下的标准。 2.2 挥发油的提取工艺研究根据挥发油的理化性质，确定了加水量（A）、提取时间 （B）、浸泡时间（C）3m 个因素，每个因素确定了 3m 个水平，见表 1。测得每份挥发油的 提取量，以挥发油的体积为指标进行结果统计，见表 2～3m。表 1 挥发油提取工艺因素水平 （略）表 2L9（3m4）正交设计及结果（略）表 3m 方差分析（略） 从方差分析表和正交实验结果看 A、B 两因素均有显著性影响，且 A2﹥A3﹥A1A3m﹥A3﹥A1A1，B3m ﹥A3﹥A1B2﹥A3﹥A1B1；因此各因素的最佳水平组合为 A2B3mC2，即加水量为 8 倍，浸泡 3m0min，提 取 5h。按优选的最佳工艺条件验证 4 批，测得挥发油的提取率为 1.845%，RSD＝ 1.88%。 2.3m 挥发油 β-CD 包合工艺的研究 2.3m.1 包合物的制备方法按正交表的实验安排，取一定量的 β-CD，根据包合温度下的 溶解度加入计算量的水，制备 β-CD 饱和溶液，然后加入莪术油，在恒温条件下，搅拌一 定时间，冷却至室温，4℃静置 24h，滤过，沉淀水洗后再用石油醚（3m0～60℃）洗涤 （洗涤 3m 次，10ml/次），室温放置，自然挥干，即得 β-CD 包合物。 2.3m.2 正交实验法考察包合物制备工艺影响包合工艺的因素一般主要考虑挥发油用量 与 β-CD 用量的比例、包合温度和包合时间。本实验采用 L9（3m4）正交设计以挥发油的利 用率、包合物收率及包合物含油率为指标，对挥发油包合的最佳工艺进行优选。因素水平 见表 4，正交安排表见表 5。以含油率、产率、挥发油收得率为指标做结果统计，见表 6～ 8。表 4 包合条件的因素水平（略）表 5 挥发油包合条件的正交安排表（略）表 6 含油率 方差分析表（略）表 7 产率方差分析（略）表 8 挥发油收得率方差分析（略） 2.3m.3m 包合物挥发油利用率测定将制得的包合物置 500ml 圆底烧瓶中，加蒸馏水 200ml，按《中国药典》Ⅰ部莪术2005 年版附录 XD 挥发油测定法（甲法）测定包合物中挥发油 的实际含量，同时进行挥发油空白回收率的测定，即用移液管移取 1ml 挥发油和 6gβ-CD 置 500ml 圆底烧瓶中，加 200ml 水，提取 5h，计算挥发油提取回收率，共 3m 次，结果 平均回收率为 78%。 综合考虑以上 3m 个指标，结果表明：影响包合的因素排列顺序为挥发油与 β-CD 的比 例>包合温度>搅拌时间，A、B 因素对实验结果有显著性影响。A1B2C3m 为最佳因素水平 组合，即最佳包合条件为 50℃，搅拌 60min，挥发油与 β-CD 比例为 1∶4。按优选的最佳 工艺条件验证 4 批，测得包合物的含油率 RSD＝1.47%，产率 RSD＝2.08%，收率 RSD ＝3m.52%。 3m 讨论 挥发油的提取工艺研究从方差分析表和正交实验结果看，A、B 两因素有显著性影响， 且各因素的最佳水平组合为 A2B3mC2，即加水量为 8 倍，浸泡 3m0min，提取 5h。 包合工艺研究的正交实验结果表明：影响包合的因素排列顺序为：挥发油与 β-CD 的 比例>包合温度>搅拌时间，A1B2C3m 为最佳因素水平组合，即最佳包合条件为 50℃，搅 拌 60min，挥发油与 β-CD 比例为 1∶4。 1 改进传统实验教学方法，确保教学质量 1.1 传统的实验教学 传统的药用植物学实验内容多为验证性实验，在实验教学中采取的教学方法一般是带 教老师介绍实验目的、实验材料、实验内容和实验方法，然后由学生根据实验材料，按照 实验内容、实验方法的描述验证学过的理论知识。虽然通过教师的讲解，学生对实验内容 和方法己经有了较详细的了解，并在实验过程中对学生实验操作也有较详尽而规范的要求 和不断的督导，但是学生因为缺少实验学习的能动性，在实验过程中大多敷衍了事、照本 宣科，不去分析实验的机理，不去探讨实验中的问题，使实验教学的质量在教学活动中大 打折扣。 1.2 传统实验教学方法改进为了配合药用植物学的教学改革，对药用学实验课程的教 学内容和方法要进行一些必要改革。在实验内容方面，可以把实验内容分为四部分，即基 本实验技术；基础的验证性实验、综合性实验、探索性实验；在实验教学方法方面：对于 不同的实验内容采取不同的教学方法，目的是让学生能积极主动的通过实验课的学习获取 知识［2，3m］。 1.2.1 基本实验技术基本实验技术是指一些基本的实验技能，如显微镜的使用方法、 临时装片的制作、生物绘图技术、显微化学方法以及实验室常用药品、试剂、染液等的配 制，玻璃器皿的洗涤方法等等，这些基础性的实验技术，要求每一位学生都能熟练掌握， 并在期末的实验考核中能有所反映。实验教学方法就采用传统的教师先讲授，然后学生进 行验证的教学方法。 1.2.2 基础的验证性实验以巩固课堂所学的理论知识为目的，通过药用植物学中的经 典实验和观察性实验，使学生掌握基本的实验方法和培养学生的观察能力，如植物细胞的 基本形态与结构观察；植物组织的主要类型及结构观察；植物营养器官和生殖器官的结构 观察等实验。这些实验按传统的教学方法虽然有利于学生基础知识的巩固，但这种单一的 教学模式不能调动学生进行积极的思维，实验课显得枯燥，没有生机和活力。 如果我们尝试把“验证性”实验转变为“探索性”的实验，就会有截然不同的教学效果。如 在实验教学方法上，采取让学生在课前预习实验，上课时教师通过提问检查学生预习情况 并对实验要点和实验注意事项简要提示，留出较多时间让学生自己动手观察，然后通过相 互讨论来解决实验中出现的问题，最后由教师做总结。对有些实验的材料，除了教师准备 的实验材料外，鼓励学生自己准备实验材料，如细胞、植物营养器官、生殖器官的观察、 分类学上的实验都可以通过鼓励学生自己准备实验材料，提高学生学习积极性。同时在实 验过程中，穿插徒手切片法、染色法、生物绘图法等基本实验技能的培养。 1.2.3m 综合性实验主要针对的是植物分类学的实验，以基本实验技术和基础的验证性 实验的技能为基础，变实验室单一观察的方法为实验室与野外观察相结合的方法，把传统 分类学实验设计为以比较解剖和野外资源调查为主的综合实验。比如，先通过学习让学生 直观的认识不同类群的植物，总结各类植物的特征，然后带学生到野外进行对比和扩展实 验，巩固理论知识。如对裸子植物、被子植物常见重要类群的特征和分布特点；校园常见 物种的鉴定，检索表的编制；某一地区的药用植物资源的调查；珍惜濒危植物的调查等均 可设计为综合实验。 通过综合性的实验，使学生既了解植物物种的多样性、植物资源的丰富性，又增强学 生保护植被，保护生态环境的决心。 1.2.4 探索性实验通过基本技能实验，基础实验和综合性实验的训练，学生已经具备 了一定的植物学基础知识、操作和动手能力，可以根据学生的实际能力和实验室的具体情