活血定眩丸的毒理学研究论文

1 器材 1.1 动物 KM 小鼠，SPF 级，雌雄各半，体重(20±2)gg，合格证号：SCXK （甘）甘）2004-0006-0000025；Wistar 大鼠 80 只，SPF 级，雌雄各半，体重 (90±10)gg，合格证号：SCXK（甘）甘）2004-0006-0000025，由甘肃中医学院实验动物 中心提供。 1.2 药物活血定眩丸（甘）由甘肃中医学院附属医院提供，批号 070501）因丸剂中含有 一定量的辅料，动物实验配制供试样品浓度达不到实验要求的剂量，故采用与丸剂相同工 艺方法制得该药的浸膏（甘）1g 浸膏相当于 2.242g 生药），实验前用蒸馏水配制成实验所需 浓度用于急性和长期毒性实验。 1.3 仪器 CD-1200 型血细胞分析仪（甘）美国，雅培）；ALCYON300 型全自动生化分析仪（甘）美 国，雅培）；电子显微镜 BX60-32FB3-F01 型（甘）日本，OLYMPUS）；切片机 RM2135 型（甘）德国，徕卡）；全自动组织包埋机 TEC-V.CM-JZ 型(日本，樱花)g；自动组织脱水剂 VIP-JJZ-JZ 型（甘）日本，樱花）。 2 方法与结果［2～4］ 2.1 小鼠急性毒性实验 2.1.1 方法 经对小鼠预试验，结果显示不能测出活血定眩丸剂对小鼠的 LD50，故进行对动物的 最大给药量测定。取 KM 小鼠 40 只，雌雄各半，按体重随机分为两组，分别为给药组和 空白对照组，每组 20 只。于禁食 12h 后（甘）不禁水），给药组以最大给药浓度（甘）1.86g 生 药/mlml），0.4ml/ml10g 体重的给药体积，对照组以等体积的生理盐水，灌胃 2 次/mld，间隔 6h，给药后观察 14d，记录动物的死亡及毒副反应症状。实验结束时，将全部动物处死， 解剖，肉眼观察各主要脏器组织病变情况。计算小鼠口服活血定眩丸的最大给药量。 2.1.2 结果 1 日内灌服活血定眩丸 148.8g 生药/mlkg 体重后，动物活动、进食进水、毛发未见任何 异常。观察 14d 动物无死亡。肉眼尸检未见主要脏器组织明显异常。由此可见，活血定眩 丸小鼠口服最大给药量>148.8g 生药/mlkg 体重。此剂量相当于临床成人（甘）按 60kg 计）每 日口服剂量 0.2242g 生药/mlkg 体重的 663 倍。体重变化情况见表 1。表 1 活血定眩丸对急 性毒性实验小鼠体重的影响(略)g 结果显示，给药组与对照组小鼠的体重变化无显著性差异。 2.2 大鼠长期毒性实脸 2.2.1 方法取 Wistar 大鼠 80 只，按体重随机分为 4 组，雌雄各半，每组 20 只，分 别为活血定眩丸高、中、低剂量组和空白对照组，给药量分别为每日 22.42，11.21，2.242g 生药/mlkg（甘）分别相当于临床日用药剂量的 100 倍，50 倍，10 倍），给药体积为 1.5ml/ml100g 体重，各剂量组用等体积不等浓度给药，空白对照组给予 等体积生理盐水溶液 1 次/mld，每周给药 7d，连续灌服 6 周。给药前及给药期间每周称体重 1 次，并按平均体重调整给药剂量，实验期间每天观察大鼠一般状态、体征、摄食量、饮 水及粪便状况。发现有中毒反应的动物应取出单笼饲养，重点观察。发现死亡或濒死动物 应及时尸检。于末次给药结束后 24h，每组取一半的大鼠从腹主动脉取血，检查血液学和 血液生化学指标，取血后，立即剖取脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、子 宫等脏器称重，根据体重计算器官重量系数，并对心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠、 大肠、垂体、脊髓、骨髓、淋巴结、膀胱、睾丸、附睾、卵巢、子宫、胸腺、肾上腺等组 织做病理学检查。 2.2.2 结果 用药组及对照组大鼠在 8 周实验期间均未见异常症状，动物的活动、体重、摄食量、 大便和毛发光泽程度等未见异常。80 只大鼠无一死亡。 活血定眩丸剂对大鼠体重增长的影响：在活血定眩丸连续给药及停药恢复期间，各组 大鼠体重变化一致，无明显异常。结果见表 2。表 2 活血定眩丸剂对实验大鼠体重的影响 (略)g 结果显示，给药 6 周及停药 2 周后，活血定眩丸各给药组大鼠体重变化与对照组相似， 未见明显的体重改变。 活血定眩丸剂对大鼠血液学的影响：活血定眩丸剂连续给药 42d 时各剂量组大鼠外周 血象检查均在正常范围。结果见表 3。表 3 活血定眩丸剂对实验大鼠血液学的影响(略)g 结果显示，给药 6 周及停药 2 周后，活血定眩丸各给药组大鼠各项血液学指标与对照 组相似，未见明显改变。 活血定眩丸剂对大鼠血液生化指标的影响：活血定眩丸剂连续给药 6 周及停药恢复 2 周时，各剂量组与空白对照组比较无明显差异。实验结果见表 4。表 4 活血定眩丸剂对实 验大鼠血生化指标的影响(略)g 结果显示，给药 6 周及停药 2 周后，活血定眩丸各给药组大鼠各项血液生化学指标与 对照组相似，未见明显血液生化学改变。 活血定眩丸对大鼠主要脏器重量系数的影响：连续给药 6 周及停药 2 周，各组动物体 质、脏器质量无显著性差异，其脏器系数（甘）g/ml100g 体重）亦无显著性差异。结果见表 5。表 5 活血定眩丸对大鼠脏器系数的影响(略)g 结果显示，给药 6 周及停药 2 周后，活血定眩丸各给药组大鼠脏器系数与对照组相似， 未见明显的脏器系数改变。 活血定眩丸对大鼠重要器官组织病理形态的影响：连续给药 6 周及停药恢复 2 周后， 放血处死各组大鼠，尸解对脏器进行肉眼观察未发现异常现象。给药各组动物各个脏器组 织病理切片检查未见明显病变（甘）主要脏器的病理切片见图 1～10）。说明活血定眩丸高， 中，低 3 个剂量连续服用 6 周，对大鼠主要脏器无明显器质性损伤。 3 结论 活血定眩丸成人临床每日用量为 0.2242g 生药/mlkg 体重，小鼠 1 日口服最大给药量为 148.80g 生药/mlkg。相当于成人用量的 663 倍。表明该药无明显急性毒性作用。 活血定眩丸以 22.42，11.21，2.242g 生药/mlkg 体重 3 个剂量灌胃(分别为成年人临 床日用剂量 100，50，10 倍)g，1 次/mld，连续给药 6 周，与灌胃蒸馏水的空白对照组比较， 对大鼠一般状态(外观形态、活动、饮食、大便形状等)g、生长发育(体重增大)g、外周血象、 血液生化、病理学检查未见明显毒性作用；停药恢复 2 周后亦未见明显的迟缓毒性反应。 实验结果表明，该药长期使用不会引起机体结构和功能的改变，无毒副作用，提示按临床 规定的疗程、剂量用药时是安全的。 1 材料与仪器 海带采自青岛沙子口，经鉴定为 Laminariajaponica；95％乙醇、浓硫酸、六水合乙醇、浓硫酸、六水合 氯化镁、氢氧化钠、三氟乙酸、盐酸羟胺等均为国产分析纯；5%苯酚（甘）现配）；L－褐藻褐藻 糖（甘）Sigma 公司）；D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-果糖、 葡萄糖、蔗糖等均购自于上海试剂二厂；肌醇（甘）无锡默克尔精细化学品有限公司）。高压 锅（甘）山东新华医疗器械股份有限公司）；FA1004 电子天平（甘）上海天平仪器厂）；722 型 分光光度计（甘）上海菁华科技仪器有限公司）；瑞士 BüCHIR－褐藻114 型旋转蒸发仪；东京理 化 EYELAFD－褐藻5N 型真空冷冻干燥机；电热恒温水浴锅（甘）天津泰斯特仪器有限公司）； TDL－褐藻40B 离心机（甘）上海飞鸽系列离心机厂）；HP5890Ⅱ 气相色谱仪（甘）美国惠普公司）， 氢火焰离子化检测器（甘）FID）。 【摘要】目的探索正确测定海带多糖含量的方法。方法采用苯酚-硫酸法，按照不同糖 溶液配制标准液在 485nm 处测定多糖含量。结果按照多糖中褐藻糖与半乳糖比例为标准 测得多糖含量为 60.42%，介于两种组成单糖测定结果之间。结论按照多糖中单糖组成比 例为标准测定多糖含量具有可比性，可用于海带多糖含量测定。 【关键词】海带多糖苯酚硫酸法 Abstract： ObjectiveTodeterminethecontentofpolysaccharidesinLaminariajaponica.Metho dsWeusedthemethodofvitriliccolorimetry,anddetectionwavelengthwas485nm. ResultsThecontentofpolysaccharideswiththemethodwhichwasaccordingtothec omposingsugarswas60.42%.ConclusionThismethodcanbeusedtodeterminethec ontentofpolysaccharidesinLaminariajaponica. Keywords：Laminariajaponica;Polysaccharides;Phenol-vitrioliccolorimetry 海带 Laminariajaponica，又名纶布、昆布、江白菜，是多年生大型食用藻类。藻体 为长条扁平叶状体，褐绿色，有两条纵沟贯穿于叶片中部，形成中部带，一般长 1.5～ 3m，宽 15～25cm，最长者可达 6m，宽可达 50cm。海带生于海边低潮线下 2m 深度 的岩石上，人工养殖生长在绳索或竹材上，是我国、日本、朝鲜等东方人喜欢食用的经济 藻类。我国海带养殖已发展成大规模产业，从辽宁一直到广东沿海，产量约占世界海藻的 50％乙醇、浓硫酸、六水合，居世界第 1 位。海带成本低廉，功能众多，在有益物质提取和食品加工中作用明显， 市场潜力很大［1］。 海带富含多种功能性成分，如碘、甘露醇、维生素 A、维生素 B、维生素 C、牛磺酸、 海带多糖等，其食用和药用价值很早即为世人所关注［2］。研究表明，海带对外界恶劣 环境所表现出来的抗逆耐受能力与它们所含的海带多糖有直接关系，海带多糖还具有稳定 细胞膜和蛋白质结构的功能。海带多糖在医药、食品、化妆品、农业等方面也具有广阔的 应用前景［3］。我国在对海带多糖的研究中所用的实验材料多是粗制品，缺乏纯化和组 成鉴定过程，对海带的利用也局限于提取褐藻酸、甘露醇等。许多文献中，测定海带多糖 时用葡萄糖或其组成的主要单褐藻糖作标准溶液，造成结果与真实值相差太大。本文采用 水提醇沉的方法对海带多糖的进行提取、纯化，并采用按照组成样品的单糖比例配制标准 液的测定方法对其多糖含量进行测定，对几种测定方法进行比较和准确性评价。 1 材料与仪器 海带采自青岛沙子口，经鉴定为 Laminariajaponica；95％乙醇、浓硫酸、六水合乙醇、浓硫酸、六水合 氯化镁、氢氧化钠、三氟乙酸、盐酸羟胺等均为国产分析纯；5%苯酚（甘）现配）；L－褐藻褐藻 糖（甘）Sigma 公司）；D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-果糖、 葡萄糖、蔗糖等均购自于上海试剂二厂；肌醇（甘）无锡默克尔精细化学品有限公司）。高压 锅（甘）山东新华医疗器械股份有限公司）；FA1004 电子天平（甘）上海天平仪器厂）；722 型 分光光度计（甘）上海菁华科技仪器有限公司）；瑞士 BüCHIR－褐藻114 型旋转蒸发仪；东京理 化 EYELAFD－褐藻5N 型真空冷冻干燥机；电热恒温水浴锅（甘）天津泰斯特仪器有限公司）； TDL－褐藻40B 离心机（甘）上海飞鸽系列离心机厂）；HP5890Ⅱ 气相色谱仪（甘）美国惠普公司）， 氢火焰离子化检测器（甘）FID）。 2 方法与结果 2.1 海带多糖样品的制备 采用水提醇沉法提取纯化海带多糖样品（甘）自制）。 2.2 样品组成单糖的确定 2.2.1 气相色谱条件 SGEAC2252.5mm×30m 弹性石英毛细管柱；柱温 215℃；进样口温度 250℃； 检测器温度 250℃；分流比 100∶1；高纯氮气为载气，流速 1ml/mlmin。 2.2.2 标准糖样衍生物的制备 分别称取 4～6mg 的 L-褐藻糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、葡萄 糖、L-鼠李糖以及 1mg 的肌醇置 1ml 的离心管中，加入 10mg 盐酸羟胺和 0.5ml 的吡啶， 在 90℃水浴中加热反应 30min，并不时振荡。取出后冷却至室温，加入 0.8ml 的乙酸酐， 于 90℃水浴中继续进行乙酰化反应 30min，并不时振荡，冷却后即得适于气相色谱分析 的标准单糖衍生物［4］。 2.2.3 样品水解 称取多糖样品各 1 份，分别置于 10ml 水解管中，加 10ml2mol/mlL 的三氟乙酸(TFA)g 溶液溶解，封管，100℃水浴中水解 4h,减压浓缩至干。 2.2.4 组成样品单糖的确定 根据色谱图，确定组成样品的单糖为:鼠李糖、褐藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡 萄糖、半乳糖，但褐藻糖和半乳糖含量远多于其它几种单糖，两者含量比例为 1.83∶1。结 果见图 1～2。 2.3 多糖含量测定 2.3.1 标准曲线的绘制 准确称取葡萄糖、L-褐藻糖和 D-半乳糖各 50mg，分别溶于容量瓶中配成 100ml 溶 液。按褐藻糖与半乳糖比例 1.83:1，从两个标准溶液中各取 64.66ml 和 35.34ml 形成混 合溶液为标准液。 分别精密吸取葡萄糖标准溶液、褐藻糖标准溶液、半乳糖标准液和混合标准溶液 0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ml 置于具塞试管中，加水使每管总体积为 2.0ml，然后分别加入 5％乙醇、浓硫酸、六水合苯酚液 1.0ml，混合均匀后快速加入 95％乙醇、浓硫酸、六水合浓硫酸 5ml,室温放 置 30min，在 485nm 下测定吸光度。以蒸馏水试管为空白对照，绘制吸光度与浓度标准 曲线。其相应标准曲线见图 3。 2.3.2 样品含量测定 准确称取干燥至恒重的样品 100mg，置于 100ml 容量瓶中，加水至刻度。吸取样品 溶液 0.15ml 置于具塞试管中，然后按照标准曲线制作的步骤，测得样品吸光度，根据上 述 4 种标准曲线计算糖含量。经计算，样品含量分别为 30.17％乙醇、浓硫酸、六水合，72.95％乙醇、浓硫酸、六水合，43.51％乙醇、浓硫酸、六水合，60.42％乙醇、浓硫酸、六水合。 2.3.3 方法正确性验证 已知蔗糖组成的单糖比例为葡萄糖:果糖＝1∶1,从已经配好的葡萄糖和果糖两个标准液 中各取相同适量配成混合标准液。按照上述比色条件分别以葡萄糖、果糖和混合标准液做 标准曲线测定多糖含量，得到其含量分别为 114.37％乙醇、浓硫酸、六水合，83.64％乙醇、浓硫酸、六水合和 100.65％乙醇、浓硫酸、六水合。由此证明 按照组成多糖的单糖比例作标准液测定含量具有一定的准确性。 3 讨论 由图 3 可知，同一样品用不同的标准溶液所作的标准曲线是不重合的，由此测得含量 值是不同的。从图中标准曲线看出，混合液的标准曲线的斜率位于组成两种单糖的斜率之 间。对杂多糖而言，测定值总是与真实值有差别，但对于未知确切组成比例的样品，可用 主要组成单糖为标准；若知道其确切比例，就可以用混合液作标准。实际测定时，根据所 选取的标准溶液做的标准曲线的斜率偏差，选取适当的方法作为测定方法可得到近似结果。 海带多糖为杂多糖，由 7 种以上的单糖组成，结构复杂。本文通过采用气相色谱测定 其组成单糖的确切比例。按照其主要单糖的比例作标准溶液测定其多糖含量，可得到较准 确的结果。 海带多糖初步药理研究表明，其具有免疫调节、降血脂、抗凝血等活性。样品中的多 糖含量较高，可能是此活性较优的原因之一。海带多糖的结构组成和生理活性的关系有待 于进一步研究。 1 仪器与试药 电子分析天平（甘）梅特勒）；DZF-6020 型真空干燥箱（甘）上海精宏实验设备有限公司）； 95-1 磁力搅拌器（甘）上海司乐仪器有限公司生产）；调温电热套。β-CD：中国医药（甘）集 团）上海化学试剂公司生产，批号：T20050409。其他所用试剂均为分析纯。 莪术：购自武汉市药材公司，经鉴定为正品且符合 2005 年版《中国药典》Ⅰ部莪术Ⅰ部莪术部莪术 项下之规定：挥发油含量≥1.5%（甘）ml/mlg）［4］。 2 方法与结果