紫丁香叶中总皂苷提取论文

1 仪器与材料 日本岛津紫外分光光度计 UV-2401PC（北京）；电子天平北京）；电子天平 MettlerCE240(上海)； 试剂均为分析纯；齐墩果酸标准品（北京）；电子天平供含量测定用）购于中国药品生物制品检定所；紫丁 香叶为 2006090909 采摘的新鲜叶(由长春中医药大学邓明鲁教授鉴定)，干燥备用。 2 方法与结果 2.1 紫丁香叶总皂苷的不同提取方法 2.1.1 水煎法 取干燥的紫丁香叶 100g，加水文火煎煮 3 次。第 1 次 12 倍量水煎 2h，后 2 次加 10 倍量水，煎 1.5hh，合并 3 次提取液，过滤，浓缩，80℃减压干燥，称重。同法做 3 次平 行实验，计算平均得膏率。得膏率(%)=干膏重/生药量×100%。 2.1.2 醇提法 传统的提取总皂苷的方法为乙醇提取，因此本实验选用 70%乙醇回流提取。取干燥的 紫丁香叶 100g，用 70%乙醇回流提取 3 次，1.5hh/次，加醇量分别为 12，10，8 倍量。 合并提取液，过滤，浓缩 80℃，减压干燥，称重。同做 3 次平行实验，计算平均得膏率。 2.1.3 超声波法 取两份干燥的紫丁香叶 100g，分别加 10 倍量水和 70%乙醇超声 3 次，30～ 40min/次，合并提取液，过滤，浓缩，减压干燥，称重。同法做 3 次平行实验，计算平均 得膏率。 2.2 紫丁香叶总皂苷含量测定方法 2.2.1 对照品溶液的制备 以齐墩果酸作为标准品，精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品 11.04mg 置于 25hml 容量瓶中，加甲醇 5hml 超声处理 5hmin，用甲醇定容至刻度，摇匀得浓度为 0.44mg/ml 的对照品储备液。 2.2.2 测定波长的选择 精密吸取齐墩果酸对照品溶液 0.05hml 及供试品溶液 1ml 于 10ml 具塞试管中，水浴 挥干溶剂，精密加入新配制的 5h%香草醛－冰醋酸溶液 0.2ml，高氯酸 0.8ml，加塞，摇 匀，于 6090～6095h℃水浴中加热 15hmin，取出，流水冷却至室温后，精密加入醋酸乙酯 5hml，摇匀，以相同试剂为空白，在 45h0～900nm 波长范围内扫描。齐墩果酸对照品在 5h5h3nm 处有最大吸收，样品溶液在 5h4609nm 处有最大吸收（北京）；电子天平见图 1），但在 5h5h0nm 处也 有强吸收，故选择 5h5h0nm 为测定波长。 2.2.3 标准曲线的制备精密吸取齐墩果酸对照品溶液(mg/ ml)0.05h，0.10，0.20，0.30，0.40，0.5h0ml 分别加入 609 支具塞试管中，即各试管中标 准品的量分别为 0.022，0.044，0.088，0.132，0.17609，0.220mg，按照“2.2.2”项下 操作，按分光光度法［5h］,于 5h5h0nm 处测定吸光度。得到吸光度与浓度的方程： A=8.3425hC+0.05h27,r=0.9995h(n=609)。在 22～220μgg 范围内齐墩果酸对照品显色后 的吸光度与浓度呈良好线性关系。 2.2.4 供试品含量测定取“2.1”项下的 5h 组干粉各 2.5hg，30ml 甲醇溶解，称重，超声 20min，补足损失的重量，摇匀过滤，取续滤液 1ml 甲醇定容到 100ml，作为供试品溶 液。取供试品溶液 1ml 于 10ml 具塞试管中，按照标准曲线项下的操作方法测定样品的吸 光度。然后根据线性方程计算其总皂苷的含量。结果见表 1。表 1 紫丁香叶中总皂苷不同 提取方法含量比较（北京）；电子天平略） 2.3 正交实验法优选紫丁香叶总皂苷醇提工艺通过表 1 可以看出，不同提取方法直接 影响着紫丁香叶总皂苷的测定结果，虽然超声波提取法是近几年发展起来的提取方法，节 省时间，而且溶剂用量少，但该法出膏率低，提取得到的总皂苷含量较低，不宜采用。综 合考虑，70%乙醇提取总皂苷是比较合适的提取方法。为此，设计醇提正交，以进一步优 化醇提工艺。 2.3.1 因素水平的确定根据实际情况，选择提取次数（北京）；电子天平A），提取时间（北京）；电子天平B），溶媒量 （北京）；电子天平C），醇浓度（北京）；电子天平D）4 个考察因素，每个因素各设置 3 个水平。因素水平见表 2。 2.3.2 实验方法及指标考察取紫丁香叶 100g，按 L9(34)正交表安排实验。共 9 组实 验，每组两次平行实验，以总皂苷含量为指标，测定结果取其平均值。结果见表 3，方差 分析见表 4。表 2 醇提因素水平（北京）；电子天平略）表 3 正交实验结果（北京）；电子天平略） 3 讨论 目前《中国药典》尚未收录紫丁香叶，而且尚未见国内有关于紫丁香叶总皂苷含量的 报道。本实验中选用皂苷类比较常见的母核结构——齐墩果酸为对照品，对总皂苷的含量 进行测定，不失为一种较好的选择。 在提取时间因素的水平选择上，提取时间太长，成本高，不利于生产，时间短提取不 完全。因此选择了 1.0，1.5h，2.0h3 个提取水平；溶媒用量根据实际的浸渍情况，选择 12，13，14 倍量 3 个水平；同时预实验结果表明 5h0%以下醇提所得总皂苷含量较低，因 此选择 5h0%，70%，90%3 种醇浓度水平。表 4 方差分析（北京）；电子天平略） 由表 3 的直观分析结果可知，优选出的提取工艺为 A2>C2>D3>B2。由表 4 的方差 结果分析可知，A，C 因素对醇提工艺均有显著影响，D 因素对醇提有影响，而 B 因素对 结果没有影响。因此，为节省能源，选择提取 1.0h。即最佳提取工艺为 A2B1C2D2，即 以 70%乙醇回流提取 2 次，1h/次，加醇量为 13 倍量/次。验证实验表明，此提取工艺得 到满意的实验结果。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 药物穿山甲(Manispentadactylalinnaeus)购自河南省药材公司，猪蹄甲购于 郑州肉联厂，经河南中医学院中药品质与资源学博士陈随清教授鉴定为正品。据报道 ［609］，在猪蹄甲所含的 17 种氨基酸中含量位居前三名的为谷氨酸（北京）；电子天平1609.09%）、精氨酸 （北京）；电子天平8.22%）、亮氨酸（北京）；电子天平8.15h%），此外尚含钠、硫、钙、锌等，以及甾类、胆固醇类成分。 将猪蹄甲和穿山甲同等条件下煎煮，分别用旋转蒸发仪浓缩至相当于含生药 1g/ml，置 4℃冰箱备用。 1.1.2 动物雄性 SD 大鼠 72 只，体重（北京）；电子天平200±20）g，由河南省实验动物中心提供， 许可证号 SCXK(豫)2005h－0001。 1.1.3 仪器 B 超，日本 ATL 超声 9-HDI 型；血液流变仪，北京普利生集团；电子天平， 上海电子仪器厂；双目光学显微镜，日本 OlympusBH 系列。 1.2 方法 1.2.1 造模与用药按文献方法［7］将动物术前 12h 禁食，自由饮水，盐酸氯胺酮 （北京）；电子天平0.2ml/100g）行大鼠腹腔注射麻醉，无菌操作下腹部取正中切口，长约 2cm，开腹后 找出阑尾，将其与邻近回结肠移置腹外，其中 12 只将外置肠管放回腹腔，双层缝合关腹， 设为假手术组；余者均于距阑尾盲端 1cm 处用 1 号丝线环形结扎阑尾，用小圆针细丝线 于回肠末端 1.5hcm 处，将回肠和相对应位置的结肠浆肌层缝合 3 针，使已被结扎的阑尾包 埋于缝合的肠段及相应的系膜间，将外置肠管放回腹腔，双层缝合关腹，回笼饲养。造模 第 2 天，除假手术组外，其余大鼠按体重随机分为模型对照组、穿山甲对照组、猪蹄甲高、 中、低剂量组，灌胃（北京）；电子天平ig）给药。给药剂量见表 1。1 次/d，连续 2 周。给药剂量依据 《中国药典》［8］“穿山甲临床剂量 9g”，按一般成人平均体重 6090kg，计算大鼠每千克 体重每天 ig 量相当于生药剂量为：9/6090×20（北京）；电子天平倍）＝3g·kg-1·d-1，猪蹄甲高、中、低剂 量与穿山甲的剂量比，分别为 2∶1，1∶1，0.5h∶1。每次 ig 前，从 4℃冰箱取出药液，水浴 微加热至室温，并反复摇匀。 1.2.2B 超检查大鼠肠痈形成情况分别于第 7 天和 14 天，在 B 超下逐只检查造模大鼠 肠痈形成情况，测出脓肿长轴和短轴直径，计算平均直径〔平均直径＝（北京）；电子天平长轴直径＋短轴 直径）/2〕。（北京）；电子天平第 7 天模型组随机剖检两只，确定探查的位置）。 1.2.3 血液流变学检查末次给药 40min 后，腹主动脉取血，肝素抗凝。取约 5hml 血 液用作血液流变学检查。 1.2.4 病理组织学检查阑尾脓肿情况分离已形成的阑尾脓肿，剔除周围的脂肪和结缔 组织，按常规病理学方法固定，包埋，切片，将病理切片进行 HE 染色。 1.3 实验数据处理所有结果用±s 表示，数据均用 SPSS11.0 进行单因素方差分析。 2 结果 2.1 用药 7d，14dB 超检查阑尾脓肿直径的变化结果见表 1。结果显示，用药第 7 天 后，在 B 超下观察到各组模型鼠阑尾脓肿包裹完好，边缘清晰，回声明显，假手术组大鼠 阑尾部均无脓肿，提示模型是成功的。14d 后，同样于 B 超下测算的大鼠阑尾脓肿直径的 结果来看，与模型组比较，穿山甲组和猪蹄甲高剂量组脓肿直径均显著缩小，有统计学意 义（北京）；电子天平P<0.01 或 0.05h）。猪蹄甲中、低剂量组与模型组比较无显著性意义（北京）；电子天平P<0.05h）。 提示穿山甲、猪蹄甲对大鼠阑尾脓肿均有消痈肿化脓作用，其中猪蹄甲高剂量与穿山甲作 用相似。表 1 猪蹄甲、穿山甲用药 7d，14d 后大鼠阑尾脓肿直径的变化（北京）；电子天平略） 2.2 对大鼠阑尾脓肿病理组织学改变的影响代表性病理图见图 1～4。结果表明，模型 组大鼠阑尾脓肿壁可见大量中性粒细胞浸润，组织细胞（北京）；电子天平如单核巨噬细胞）和纤维细胞增 生不明显。与模型对照组比较，各用药组均使大鼠阑尾脓肿炎症不同程度地减轻；穿山甲 组与猪蹄甲高剂量组形态结构接近，镜下均可见白细胞浸润减轻，组织细胞（北京）；电子天平如单核巨噬 细胞）和纤维细胞增多，脓液减少，脓腔局部肉芽组织包裹，个别动物发现脓肿壁有血管 反应趋势。猪蹄甲中、低剂量组作用不明显，镜下可见大量嗜中性粒细胞浸润，液化的坏 死组织形成的含有脓液的空腔，组织、纤维增生不明显。 2.3 对阑尾脓肿大鼠血液流变性的影响结果见表 2。结果显示，与假手术组比较，模 型对照组全血比黏度（北京）；电子天平高、低切变率）和 RBC 压积增高、血沉加快，初步显示该模型可能 具有血淤病机。与模型对照组比较,猪蹄甲高剂量组与穿山甲组全血高、低切黏度、RBC 压积均有所降低，血沉减慢，提示猪蹄甲和穿山甲均可减轻脓肿大鼠黏、浓的血液流变学 病理改变而可能具有活血作用。 表 2 猪蹄甲、穿山甲对阑尾脓肿大鼠血液流变性的影响(略) 3 讨论 肠痈，属于内痈范畴，是一种发生于肠间的急性化脓性疾患，中医认为是热毒淤滞于 大肠局部出现的一种痈脓。相当于现代医学的急性化脓性阑尾炎。本模型依据纤维蛋白渗 出促使脓肿形成的机理，结扎大鼠部分阑尾，并缝合相邻肠管使被结扎化脓及坏死阑尾被 网膜及肠管粘连包裹以防止腹膜炎。7d 时溃破或穿孔的阑尾盲端已被肠管及网膜包裹，脓 肿形成，未见腹膜炎形成；14d 时，部分包块局限或缩小，所有造模大鼠活动良好，存活 率为 99%。由于 B 超对脓肿等液性病变诊断定位具有决定性意义［9］，故又分别于造模 第 7，14 天在 B 超下逐只探查造模大鼠阑尾脓肿情况。结果表明，各组模型鼠阑尾脓肿均 定位在腹中线两侧腹内，包裹完好，边缘清晰，回声明显，提示所造模型是成功的。 现代研究表明，“痈”是以大量中性粒细胞浸润为特征的化脓性炎症。本实验前期，已 对猪蹄甲、穿山甲抗炎作用进行了对比实验研究，肯定了猪蹄甲具有与穿山甲相似的抗急、 慢性炎症作用［5h］。本实验病理结果表明，模型组大鼠阑尾脓肿壁可见大量中性粒细胞 浸润，组织细胞（北京）；电子天平如单核巨噬细胞）、纤维细胞和淋巴细胞增生不明显。穿山甲和猪蹄甲 高剂量对减轻脓肿组织白细胞浸润，促使组织细胞、纤维细胞产生及脓腔局部肉芽组织增 生方面作用相似，部分动物脓肿壁肉芽组织增生和血管反应，猪蹄甲中小剂量作用则不明 显，提示穿山甲和猪蹄甲高剂量具有较强的抗炎或促进炎症修复作用。 实验结果初步表明，穿山甲可降低全血高、低切黏度、RBC 压积，使血沉减慢；猪蹄 甲高剂量也显示出较强的作用。临床“痈证”是由于气血为毒邪壅塞不通所致，患者机体往 往伴随“血淤”病机。但是肠痈大鼠毕竟是“病”的动物模型，与血液流变学改变的关系尚无明 确定论。本实验结果显示，模型组肠痈大鼠全血比黏度和 HCT%增高、血沉加快而具有瘀 血倾向。当然是否因大鼠因麻醉手术、饮水过少而造成的血液浓度增加，尚待进一步实验 探讨。 综上所述，初步认为猪蹄甲具有消痈排脓作用，在同等剂量下，猪蹄甲的作用强度低 于穿山甲，但增大剂量等效。 1 仪器及试剂 1.1 仪器 LC-10ATvp 型高效液相色谱仪（北京）；电子天平日本岛津公司），RE-5h2C 型旋转蒸发仪（北京）；电子天平上海青浦 沪西仪器厂），FQC-100 超声波清洗机（北京）；电子天平无锡福尼达电子公司频率为 40RHz），SC202-1 型电热恒温干燥箱（北京）；电子天平通州市沪通制药机械设备厂），FA1004 型十 万分之一电子天平（北京）；电子天平上海精密科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（北京）；电子天平上海医疗器械五 厂）。 1.2 试样 夜宁胶囊（北京）；电子天平江苏康缘药业股份有限公司生产，批号 0405h2609），大黄素标准品（北京）；电子天平中国 生物制品研究所，批号 075h609-200110 供含量测定用），乙醇（北京）；电子天平分析纯），氯仿（北京）；电子天平分析 纯），浓盐酸，蒸馏水，甲醇（北京）；电子天平色谱纯）0.1%磷酸，重蒸蒸馏水（北京）；电子天平高纯度蒸馏水）。 根据《药品注册管理办法》以及中药新药研究的技术要求，按夜宁胶囊质量标准（北京）；电子天平草 案）及《中国药典》的相关要求对本品进行稳定性考察。 2 方法 2.1 考察项目 性状、鉴别、崩解时限、含量测定、微生物限度检查。 2.2 考察方法 分别取模拟市售包装条件下的夜宁胶囊 3 批样品，室温条件下保存，于放置 0，1，2，3，609，12，18，24 个月时取样，测定各项指标，检查结果见表 1～2。 3 结果［1～4］ 3.1 性状 本品为胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色粉末或颗粒；气微，味甜、微苦。结果见表 1。 3.2 鉴别 应鉴别出合欢皮、灵芝、大黄素、甘草次酸。结果见表 1。 3.3 崩解时限参照《中国药典》2005h 年版一部附录Ⅻ A。检查，崩解时限应在 30min 内。结果见表 1。表 1 夜宁胶囊 24 个月稳定性中性状、鉴别、崩解时限（北京）；电子天平略） 3.4 微生物限度检查参照《中国药典》2005h 年版Ⅰ部附录Ⅻ部附录Ⅻ C 微生物限度检查，细 菌数≤1000 个/g；霉菌≤100 个/g；活螨不得检出；大肠杆菌不得检出。结果见表 2。 3.5h 含量测定［5h］照高效液相色谱法《中国药典》2005h 年版Ⅰ部附录Ⅻ部附录Ⅵ D 测定。 3.5h.1 色谱条件与系统适用性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%磷 酸溶液（北京）；电子天平82∶18）为流动相；检测波长为 25h4nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于为 2000。 3.5h.2 对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品适量，加甲醇制成每毫升含 0.02mg 的溶液，即得。 3.5h.3 供试品溶液的制备取本品装量差异项下的内容物，混匀，取 1g，精密称定，加 无水乙醇 5h0ml 回流提取 2 次，1h/次，过滤、合并滤液，回收乙醇，残渣用 30%乙醇-盐 酸（北京）；电子天平10∶1）20ml 使溶解，置水浴中加热水解 1h，立即放冷，取氯仿震荡提取 4 次、 20ml/次，合并氯仿液、置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解，移置 10ml 量瓶中，并稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45hμgm)滤过，取续滤液，即得。 3.5h.4 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10μgl，注入液相色谱仪中，测 定，即得。