木瓜籽镇咳祛痰研究论文

一、实验材料 1.动物。清洁级昆明种小鼠,体重(22.0±2.0)g,g,雌雄兼用,由吉林大学动物实验中心提 供。 2.木瓜籽提取液的制备。宣木瓜购自湖北宣城水果批发市场,经吉林大学药学院张静敏 教授鉴定为宣木瓜。去果肉,取木瓜籽 1kg,用 75%的乙醇加热回流提取 3 次,每次 2 小时, 过滤,合并滤液,除去乙醇以后制成 1L 的溶液(简称原液)g,,取原液 100ml,稀释成 500ml(简 称稀释液)g,。 3.仪器和试剂。盐酸依普拉酮片,上海衡山制药有限公司,批号:070510;氨水,分析纯, 国药集团化学试剂有限公司,批号,070102;氯化铵,分析纯,国药集团化学试剂有限公司,批 号,060520;722 型光栅分光光度计,山东高密彩虹分析仪器有限公司;梅特勒 AB135-S 十 万分之一天平,德国;HH-42 快速恒温数显水箱,常州国华电器有限公司;其它试剂购于北京 化工。 4.统计学处理。应用 SPSS13.0 统计分析软件进行处理,实验数据以均数±标准差 (x±s))g,表示,实验结果进行多变量方差分析及 T 检验。 二、方法 1.镇咳作用研究。为研究木瓜籽提取物对小鼠镇咳作用的影响,选取昆明种小鼠雌雄各 20 只,随机分成 4 组,每组 10 只。用药组分别灌胃原液和稀释液 20ml/kg,对照组灌胃等量 生理盐水,阳性组直接用盐酸依普拉酮(20mg/kg)g,灌胃给药。连续给药 3d,末次给药 1h 后, 将每只小鼠分别置于引咳笼中,使小鼠接受饱和氨水的喷雾刺激 5s),从喷雾氨水开始计时,以 腹肌收缩,张嘴为准,观察和记录小鼠的刺激潜伏期及 2min 内咳嗽次数。 2.祛痰作用研究。为研究木瓜籽提取物的祛痰作用,采用酚红气管排泌法。 (1)g,酚红标准曲线的绘制。用天平精确城区酚红 0.100g,加 5%NaHCO3 溶液至 1000ml 容量瓶中。分别吸取此酚红溶液 0.25,0.5,0.75,1.00,1.25,1.50,1.75,2.00ml 于容量瓶中,加水稀释至满刻度,用 722 分光光度计于 546nm 波长下测其吸光度,得回归方 程 x=0.2257+5.3268y,r=0.9990,并绘制标准曲线。 (2)g,选取昆明种小鼠雌雄各 20 只,随机分成 4 组,每组 10 只。用药组分别灌胃原液和稀 释液 20ml/kg,对照组灌胃等量生理盐水,阳性组氯化铵组(2.0g/kg)g,灌胃给药。每只小鼠灌 胃给药 30min 后,腹腔注射 5%酚红生理盐水溶液 10ml/kg,30min 后脱臼处死,剥离气管 周围组织,剪下自甲状软骨至气管分支处的一段气管,放入盛有 1ml 蒸馏水的试管中,再加入 1mol/LNaOH 溶液 0.1ml,以 1ml 蒸馏水/0.1mlNaOH 溶液为空白,546nm 处测量溶液的 吸光度(A)g,。 三、结果 1.镇咳作用 结果见表 1。原液组、稀释组能显著抑制氨水诱发小鼠的咳嗽潜伏期和咳嗽次数,显示 其具有镇咳作用,且呈现量效关系。 2.祛痰实验 结果见表 2。由表 2 可见,原液组及稀释液组的木瓜籽的乙醇提取物均能增加小鼠气管 的酚红排泌量,呈现量效关系,原液组效果优于氯化铵阳性对照组,提示木瓜籽具有祛痰作用。 四、讨论 采用抑制氨水诱咳的方法,研究了木瓜籽乙醇提取物的镇咳作用。本实验首次发现了木 瓜籽乙醇提取物的镇咳作用,这可能与提取物中的酚苷类成分有关;采用酚红气管排泌法研 究了木瓜籽乙醇提取物的祛痰作用,实验表明木瓜籽有祛痰作用,但作用不如镇咳那样显著。 可能与提取部位有关,需要进一步活性筛选。 本文从镇咳祛痰两方面对木瓜籽润肺化痰的功效进行了初步药理研究。结果表明,高剂 量组效果明显高于低剂量组,显示出了镇咳祛痰活性,但其量效关系及镇咳祛痰有效成分还 需进一步研究。由于木瓜籽多被扔倒,甚为可惜,经过研究可发现,一方面利于变废为宝,一方 面又促进开发其新的药理活性。本实验为最终阐明木瓜籽润肺化痰作用物质基础提供了药 理实验依据。 1 中草药研究动态 1.1 去甲斑蝥素范跃祖等观察了去甲斑蝥素(NCTD))g,对胆囊癌肿瘤血管生成的抑制作用 及其机制 NCTD) 可有效抑制、破坏胆囊癌肿瘤血管生成,进而抑制胆囊癌的增殖与生长。其 机制可能与 NCTD) 诱导血管内皮细胞凋亡、直接破坏血管内皮细胞、改变血管内皮细胞 PCNA/凋亡比、下调血管生成因子 VEGF、Ang22 和上调血管抑制因子 TSP、TIMP2 表达 有关［1］。 1.2 小檗碱小檗碱(berberine)g,为黄连(毛茛科植物)g,、黄柏等(芸香科植物)g,植物的一种 生物碱,作为抗菌药已有悠久的历史。初步研究表明它在体内、体外对多种肿瘤细胞具有较 强的抑制和杀伤作用［2］。娄金丽等研究小檗碱对 bFGF 活化人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)g,增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响,探讨其对肿瘤新生血管形成作用的机制。方 法:MTT 法检测小檗碱对 bFGF 活化 HUVEC 的增殖作用;流式细胞仪检测用药后细胞周期 的变化;激光共聚焦扫描显微镜下观察药物对细胞形态、细胞内钙的影响;流式细胞仪检测 小檗碱对细胞凋亡的作用。结果:小檗碱能明显抑制 bFGF 活化的 HUVEC 增殖,且存在剂量 依赖关系;使细胞在 G02G1 期的比例明显增多;使细胞核浓缩、甚至裂解成碎块,同时使细 胞内钙增多;并诱导活化 HUVEC 发生细胞凋亡。结论:小檗碱可能通过将 bFGF 活化的 HUVEC 细胞周期阻滞在 G02G1 期,抑制活化 HUVEC 的增殖;诱导活化 HUVEC 细胞发生 凋亡等机制,阻止新生血管形成,发挥其抗肿瘤作用［3］。 1.3 白藜芦醇白藜芦醇是广泛存在于葡萄、花生和多种药用植物中的一种多酚类化合 物，目前至少已经在 21 个科，31 个属的 72 种植物中发现了白藜芦醇。早期研究发现， 白藜芦醇具有保护心血管，调节血脂、抗病原微生物、护肝等多种生物学作用。自从 Jang 等于 1997 年系统报道了白藜芦醇的抗肿瘤作用后，迄今已发现白藜芦醇能通过多种途径 抑制肿瘤细胞的起始，促进，发展三个阶段，而且可以抑制肿瘤血管形成。1.对内皮细胞 的作用，能够直接抑制血管内皮细胞的增生，迁移及诱导其凋亡，从而抑制血管的生成。 2.对血管生长因子及受体的调控，可以通过下调各种血管生成促进因子及受体的水平，近 而抑制血管的形成。3.对基质金属蛋白酶（MMP）的影响，白藜芦醇能够直接抑制的影响，白藜芦醇能够直接抑制 MMP22 的表达及活性，同时体外实验发现白藜芦直接抑制 HUVEC 细胞分泌 MMP22 溶解 明胶的活性，从而抑制细胞的生长，管形的形成.4.抗凝作用，研究表明，白藜芦醇可以通 过抗凝作用阻止血管的生成。5.对黏附分子的影响，白藜芦醇抑制肿瘤坏死因子（TNF）的影响，白藜芦醇能够直接抑制 激活的人 HUVEC 和人单核细胞产生 ICAM21 及 VCAM21，降低细胞之间的黏附能力。6. 对环氧化酶的影响，白藜芦醇使肿瘤组织环氧化酶 2（COX222）的影响，白藜芦醇能够直接抑制MRNA 的表达减少，从而 抑制肿瘤的血管的形成。7.对 INOS 的影响，研究表明白藜芦醇通过抑制巨噬细胞中脂多 糖诱导的 NF2KB 而减少胞质蛋白稳定的 MRNA 水平［4］。 1.4 姜黄姜黄主要活性成分是姜黄色素和挥发油,具有抗炎、抗氧化、降血脂和抗肿瘤 等多种作用。近年来,姜黄活性成分的抗肿瘤作用引起了广泛关注。姜黄素、脱甲氧基姜黄 素和双脱甲氧基姜黄素是姜黄中的三种主要色素,混称姜黄色素。李剑明等研究证明，3 种 姜黄色素单体能够抑制内皮细胞生长,表明抑制血管生成是其抗肿瘤的主要机制之一 ［5］。 1.5 逆癌酮以往研究发现丹参酮具有抗肿瘤作用。逆癌酮是以丹参酮为主要成分的中 药制剂。作者以逆癌酮对 A549 细胞系和 PLA2801D) 细胞系恶性表型的逆转作用研究结果 表明,在体外状态下,逆癌酮可下调肿瘤细胞 VEGF、CD)44V6 的表达水平,上调 PLA2801D) 细胞的 nm232H1 的表达水平。提示逆癌酮有抗肿瘤血管生成效应［6］。 1.6 海参实验研究证实,海参的活性成分具有抗凝血、抗肿瘤、增加免疫力及抗病毒等 作用。胡人杰等发现海参与可的松合用有极为明显的抑瘤增效作用。肝素与可的松合用具 有肿瘤血管生成抑制作用,而海参的化学结构、生物活性与肝素有相似之处,故推测海参与 可的松合用能抑制肿瘤血管生成［7］ 1.7 乌三颗粒乌三颗粒主要功效为益气养阴、软坚散结。石锦萍等进行了乌三颗粒对 肿瘤新生血管形成干预的研究。作者采用免疫组化染色法、病理彩色图像定量分析法,对小 鼠 S180 肉瘤组织进行了 MVD)、VEGF、bFGF 表达的检测。结果显示,乌三颗粒能明显下 调 MVD)、VEGF、bFGF 的表达,表明乌三颗粒对肿瘤血管生成有明显的干预作用,这可能 是乌三颗粒抗肿瘤的重要机制之一［8］。 1.8 人参皂苷 Rg3 人参皂苷 Rg3 是中药人参中的四环三萜皂苷,其分子式为 C24H72O13。研究表明,人参皂苷 Rg3 体外对小鼠腹水肝癌细胞(MM1)g,、黑素瘤 B16FE7 细胞、人小细胞肺癌细胞(OC210)g,和人胰腺癌细胞(PSN21)g,的浸润具有较强的抑 制作用。人参皂苷 Rg3 对高转移性小鼠黑素瘤 B16FE7 细胞肺转移及 Balb/C 小鼠结肠癌 细胞肺转移具有抑制作用。其抗肿瘤转移机制与其抑制肿瘤细胞浸润、黏附和抗血管生成 的活性有关［9］。 1.9 大豆异黄酮选用人乳腺癌细胞株 MCF27 裸鼠异种移植,探讨大豆异黄酮及其主要 有效成分金雀黄素对人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长及其血管生成的影响,通过观测移植瘤的 重量、出瘤时间、成瘤率,同时,应用免疫组化技术观察 MVD)。结果显示,肿瘤组织内可见形 态不规则,且无明显管腔的新生血管,血管分布以肿瘤组织的边缘处为多见,各组微血管计数 金雀黄素组最少,出瘤时间及成瘤率各治疗组都明显减少,以金雀黄素组最为明显,其次是高 黄酮组和低黄酮组。根据实验可以看出,大豆异黄酮的主要有效成分金雀黄素能减少肿瘤血 管生成,从而抑制裸鼠移植瘤在体内生长［10］。 1.10 鲨鱼软骨提取物近 10 年来,不同的实验室从不同的鲨鱼软骨中获得了相对分子量 大小不一、生物活性也有差异的鲨鱼软骨血管生成抑制因子(SCAIF)g,。它们都具有抑制血 管生成的生物活性和对荷瘤小鼠的确切抑瘤效果。2000 年和 2001 年,有学者从我国沿海 鲸鲨软骨中提取分离子两种高度纯化了的血管生成抑制因子 SCAIF1 和 SCAIF80,它们对 内皮细胞的增殖与迁移具有显著抑制活性。对鸡胚尿囊膜血管生成也有明显抑制作用,并且 均呈剂量依赖关系［11］。 2 结语 综上所述，笔者认为:“血瘀”←→血管内皮细胞损伤←→血管内皮细胞增殖←→肿瘤血 管生成，这其中存在着互为影响的内在联系。活血化瘀药物通过修复血管内皮细胞损伤,抑 制其增殖,可能有效改善组织缺血缺氧的"血瘀"状态,而消除肿瘤新生血管生成的条件,在血 管形成前期阻断肿瘤病变进一步向恶性发展。加强活血化瘀与恶性肿瘤血管生成调节因子 关系的研究,对明确不同类型的活血化瘀治疗肿瘤的适应证,筛选更具针对性和有效性的抗 肿瘤血管生成的活血化瘀方药,探索活血化瘀治疗恶性肿瘤的机制等都具有较大的意义和指 导作用。 1 资料与方法 1.1 菌种与培养基试验菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯 氏菌，由浙江省台州医院微生物实验室友情赠送。牛肉膏蛋白胨培养基按文献［4］自制， PH 为 6.0（用 PBS 配制［5］）的影响，白藜芦醇能够直接抑制。 1.2 五味子提取物的制备五味子饮片购自临海市医药有限公司，经 70℃烘干后研成粉 末。取粉末 10g 用 75％乙醇在超声波清洗器中提取，反复多次，直至浸出液色淡。将浸 出液浓缩，并定容到 10ml，即 1ml 提取液为 1g 五味子的提取物［6］。提取液过 0.22μmm 滤膜除菌，4℃贮存备用。 1.3 抑菌试验 1.3.1 抑菌效力的测定将供试菌从斜面转接到 5ml 液体培养基，30℃培养 24h，吸取 50μml 到 5ml 液体培养基，30℃培养 6h 后取 100μml 菌液均匀涂布到平板上；再贴上滤纸 圆片（φ6mm，提取液浸 24h 后风干）的影响，白藜芦醇能够直接抑制，每皿 4 片，重复 3 次。37℃倒置培养 24h 后测 定抑菌圈大小，用无菌水作空白对照，确定抑菌效果。 1.3.2 最低抑菌浓度（MIC）的影响，白藜芦醇能够直接抑制的测定采用二倍稀释法［7］测定提取物对供试菌的 MIC。取 7 支试管，第 1 支加入 10ml 提取液，其余 6 支各加入 5ml 无菌水，从第 1 支吸 取 5ml 提取液移至第 2 支，混匀后，再吸取 5ml 至第 3 支，以此类推，最后 1 支试管取 出 5ml 弃去，每一试管的浓度分别为 1000、500、250、125、62.5、31.3 和 15.6mg/ml。分别将 5ml 上述各浓度的提取物与 20ml 牛肉膏固体培养基混匀，制成提 取物的浓度分别为 200、100、50、25、12.5、6.3 和 3.2mg/ml（w/v）的影响，白藜芦醇能够直接抑制的平板，接种 菌液后倒置培养 24h 观察，以没有供试菌生长的最低浓度为提取物的 MIC。 1.3.3 热稳定性试验将五味子提取液置于 80℃水浴、100℃水浴和 121℃湿热条件 下［8］热处理 20min，再制成浓度为 500mg/ml 的提取液浸泡滤纸片，稍风干后贴在涂 有菌液的平板中，测定其抑菌效果。 2 结果与分析 2.1 提取物浓度对抑菌效力的影响滤纸片法测定结果（见表 1）的影响，白藜芦醇能够直接抑制显示，五味子提取物 对 4 种供试菌的生长均有很强的抑制作用，其中对绿脓杆菌的抑制作用最强，肺炎克雷伯 氏菌其次，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最弱。 表 1 五味子提取物的浓度对抑菌效率的影响（略）的影响，白藜芦醇能够直接抑制 2.2 不同菌的 MIC 提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌 的 MIC 值如表 2 所示。除金黄色葡萄球菌的 MIC 为 50mg/ml 外，其余 3 种菌均为 25mg/ml（与滤纸片法基本一致）的影响，白藜芦醇能够直接抑制。 表 2 五味子提取物的 MIC（mg/ml）的影响，白藜芦醇能够直接抑制（略）的影响，白藜芦醇能够直接抑制 “－”表示无菌生长，“+”表示细菌生长 2.3 提取物的热稳定性试验提取物经 3 种温度的热处理 20min 后，仍具有较强的抑菌 效力，其抑菌圈直径与未经高温处理的样品接近，其中只有对绿脓杆菌抑制作用，经 100℃处理和湿热灭菌后有显著下降，对金黄色葡萄球菌的抑制作用，经湿热灭菌后有显 著降低；而对大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌抑制作用，3 种处理与对照均无显著差异（见表 3）的影响，白藜芦醇能够直接抑制。说明五味子的抑菌成分具有一定的热稳定性。 表 3 热处理对五味子提取物抑菌效力的影响（略）的影响，白藜芦醇能够直接抑制 不同字母表示 P＜0.05 水平显著，ns) 为不显著 3 结论 经反复实验，结果表明五味子提取物的浓度在 31.3～1000mg/ml 范围内，对 4 种供 试菌的抑制效应依次为：绿脓杆菌>肺炎克雷伯氏菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌。滤纸片 琼脂扩散法结果显示，除金黄色葡萄球菌 MIC 为 62.5mg/ml 外，其余 3 种供试菌 MIC 均 为 31.3mg/ml；采用二倍稀释法测得的 MIC 也显示类似的结果，金黄色葡萄球菌的 MIC 为 50mg/ml，另 3 种菌的 MIC 均为 25mg/ml。另外，五味子提取物经短时高温处理后， 其活性成分不变，仍保持较强的抑菌效果。 1 资料与方法 1.1 菌种与培养基试验菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯 氏菌，由浙江省台州医院微生物实验室友情赠送。牛肉膏蛋白胨培养基按文献［4］自制， PH 为 6.0（用 PBS 配制［5］）的影响，白藜芦醇能够直接抑制。 1.2 五味子提取物的制备五味子饮片购自临海市医药有限公司，经 70℃烘干后研成粉 末。取粉末 10g 用 75％乙醇在超声波清洗器中提取，反复多次，直至浸出液色淡。将浸 出液浓缩，并定容到 10ml，即 1ml 提取液为 1g 五味子的提取物［6］。提取液过 0.22μmm 滤膜除菌，4℃贮存备用。 1.3 抑菌试验 1.3.1 抑菌效力的测定将供试菌从斜面转接到 5ml 液体培养基，30℃培养 24h，吸取 50μml 到 5ml 液体培养基，30℃培养 6h 后取 100μml 菌液均匀涂布到平板上；再贴上滤纸 圆片（φ6mm，提取液浸 24h 后风干）的影响，白藜芦醇能够直接抑制，每皿 4 片，重复 3 次。37℃倒置培养 24h 后测 定抑菌圈大小，用无菌水作空白对照，确定抑菌效果。 1.3.2 最低抑菌浓度（MIC）的影响，白藜芦醇能够直接抑制的测定采用二倍稀释法［7］测定提取物对供试菌的 MIC。取 7 支试管，第 1 支加入 10ml 提取液，其余 6 支各加入 5ml 无菌水，从第 1 支吸 取 5ml 提取液移至第 2 支，混匀后，再吸取 5ml 至第 3 支，以此类推，最后 1 支试管取 出 5ml 弃去，每一试管的浓度分别为 1000、500、250、125、62.5、31.3 和 15.6mg/ml。分别将 5ml 上述各浓度的提取物与 20ml 牛肉膏固体培养基混匀，制成提