山茱萸炮制品探讨论文

【摘要】目的比较山茱萸不同炮制品中马钱素含量。方法高效液相色谱法。结果各炮 制品中的马钱素含量相对于生品含量有所降低。结论不同的炮制方法对山茱萸中的马钱素 含量有明显影响。 【关键词】山茱萸；炮制；马钱素；高效液相色谱法 TheComparisonoftheContentsofLoganininFructusCornibyDifferentProcesse s Keywords：FructusCorni;Process;Loganin;HPLC 山茱萸具有补益肝肾、涩经固脱之功效，用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿、 尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等症，是成药六味地黄丸、八味地黄丸等的重要原 料。目前认为山茱萸中所含的熊果酸、齐墩果酸、山茱萸苷、马钱素、没食子酸、莫诺苷 等为其主要活性成分［1］，具有降低血糖、增强免疫、利尿、降压、抗炎等药理作用 ［2］。《中国药典》2005 版规定测定马钱素含量作为山茱萸药材质量控制指标［3］。 山茱萸临床和入中成药多用其炮制品，并认为山茱萸生用以敛阴止汗力强，蒸制后以补肾 涩精，固精缩尿力胜，酒炙后借酒力温通，助药势，降低其酸性，滋补作用强［4］。马 钱素作为山茱萸中水溶性有效成分之一，其结构属于环烯醚萜苷类成分，炮制加热和加辅 料对其含量肯定有一定影响，但目前尚未见到有关报道。本研究以马钱素为考察指标，比 较不同炮制方法对其含量的影响，以期为制定山茱萸合理的炮制工艺提供实验依据。 1 器材 1.1 仪器与试剂 BS210S 型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；高效液相色谱 仪：LC-2010A(SHIMADZU)；检测器 SPD-M10A；工作站：Class－VP；H66025T 超 声清洗机（无锡超声电子设备厂）；101A-2 型干燥箱（中华人民共和国上海市实验仪器 总厂）；LDZX-40BI 型立式自动电热压力蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂）。马钱素对 照品（由北京格润得科技公司提供，纯度在 98%以上）；黄酒（河南濮阳亚光酒厂）；甲 醇（天津四友生物有限公司）、乙腈(杭州百林)为色谱纯；氯仿、无水乙醇等均为分析纯。 1.2 药材由宛西制药股份公司提供，产于河南西峡县山茱萸 GAP 种植基地，经河南中 医学院生药学科陈随清教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸 CornusofficinalisSiet.etZncc.的 干燥成熟果肉。 2 方法 2.1 样品制备根椐《中国药典》净制要求，取山茱萸样品，除去杂质和残留的果梗和 核，即为净山茱萸，再按不同炮制方法的要求炮制成为以下实验样品。 2.1.1 生品取山茱萸样品，除去杂质和残留的果梗和核，放置备用。 2.1.2 加压酒蒸品取净山茱萸 100g，缓慢加入 40ml 黄酒搅拌均匀，加盖密闭闷润 20min 后将样品放入压力锅中蒸制，待温度升至 115℃后，保持该温度 1h，取出摊于瓷 盘中，于烘箱中 80℃烘 3h 至干，取出，置干燥器中放凉备用。 2.1.3 酒蒸品取净山茱萸 100g，缓慢加入 40ml 黄酒搅拌均匀，加盖闷润 40min， 置于滤布上摊开，放在蒸笼上蒸 3h 后，于烘箱中 80℃烘 3h 至干，取出，置干燥器中放 凉备用。 2.1.4 酒炖品取净山茱萸 100g，缓慢加入 20ml 黄酒搅拌均匀,加盖闷润 60min，置 不锈钢锅中，隔水炖 3h，摊于瓷盘中，于烘箱中 80℃烘 3h 至干，取出，置干燥器中放 凉备用。 2.1.5 清蒸品取净山茱萸 100g，置于滤布上摊开，放在蒸笼上蒸 3h 后，取出摊于瓷 盘中，于烘箱中 80℃烘 3h 至干，取出，放于干燥器中放凉备用。 2.2 山茱萸不同炮制品中水分含量比较按照《中国药典》规定方法［3］分别称取山茱 萸炮制品粗粉 3g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，精密称定，打开瓶盖，在 105℃ 干燥 5h，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却 30min，精密称定重量，再在上述温度干燥 1h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过 5mg 为止。根据减失的重量，计算山茱 萸不同炮制品中水分的含量。结果见表 1。表 1 山茱萸不同炮制品中水分的含量结果 （略） 从山茱萸不同炮制品中水分含量可以看出，所有炮制品中含水量都在 7%～13%以内， 符合《中国药典》规定。此外，实验中所有炮制样品中的马钱素含量都按干燥品计算。 2.3HPLC 法测定马钱素含量 2.3.1 色谱条件色谱柱为 ODS 柱 4.6mm×250mm(大连依利特)；乙腈-水 （15∶85）为流动相；检测波长 240nm；柱温 25℃；流速 1ml/min；分析时间 20min。 2.3.2 对照品溶液的制备精密称取马钱素对照品 0.46mg 置 2ml 容量瓶中，加甲醇 (色谱纯)使溶解并定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤（0.45μmm）,即得浓度为 0.23mg·ml-1 马钱素对照品溶液。 2.3.3 标准曲线绘制依次自动进样马钱素对照品溶液 1，3，5，7，9μml 于高效液相色 谱仪中，按上述色谱条件测定,并对结果进行分析。以峰面积积分值为纵坐标，对照品含量 为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为：Y=1274329.13X-17626.1，r=0.9999。结果 表明在 0.23～1.15μmg 范围线性关系良好。见表 2 和图 1。表 2 山茱萸马钱素标准曲线数 据（略） 2.3.4 精密度实验连续自动进样马钱素对照品溶液 5μml，按前述条件测定峰面积积分值， 计算 RSD 值，结果表明精密度良好 RSD=0.097%。结果见表 3。表 3 精密度考察结果 （略） 2.3.5 稳定性实验分别在 0，2，4，6，8，10h 自动进样马钱素对照品溶液 5μml，照 前述色谱条件测定峰面积积分值计算 RSD 值，结果表明马钱素在 10h 内稳定性良 好,RSD=0.15％。结果见表 4。表 4 稳定性考察结果（略） 2.3.6 重复性实验称取山茱萸同一样品粗粉 5 份各约 1g，精密称定，按照供试品溶液 制备方法和色谱条件，制备供试品溶液并注入高效液相仪，计算含量，RSD=1.63％。结 果见表 5。表 5 重复性实验结果（略） 2.3.7 加样回收率实验取已知马钱素含量的山茱萸粉末约 0.5g，精密称定，共 5 份， 分别加入马钱素对照品，以下按供试品溶液制备项下操作，得到 5 份加样回收供试液。自 动进样各加样供试液 10μml，测定，用外标法根据峰面积积分值进行计算。结果见表 6。表 6 加样回收率实验结果（略） 每份加入对照品 4.040mg，样品含量 8.0810mg·g-1。 2.3.8 供试品溶液的制备各取样品粗粉约 1g，精密称定，置具塞三角瓶中，加入 30%甲醇 10ml，超声提取 15min，倾出上清液抽滤，重复上述操作 4 次，用适量 30﹪ 甲醇清洗残渣,合并滤液，定容至 50ml 容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。 2.3.9 样品含量测定取各供试品溶液分别自动进样 5μml，测定马钱素峰面积积分值，计 算样品含量。对照品和样品色谱图见图 2～4。结果见表 7。表 7 不同炮制品中的马钱素含 量（略） 熊果酸含量和马钱素含量均是以干燥品计，且是两次测定的平均值 从表 7 可知，马钱素含量相对于生品含量均有所降低，由高到低依次为生品>酒炖品 >加压酒蒸品>酒蒸品>清蒸品。 3 讨论 3.1 山茱萸由于药用历史悠久，炮制方法较多，本实验所采取的是临床常用的炮制方 法，加压酒蒸、清蒸、酒炖、酒蒸等炮制工艺中的加酒量、闷润时间、炮制时间，均经正 交实验优选确定。由于实验内容较多，篇幅所限，正交实验的研究过程没有报道。 3.2 实验结果表明，不同炮制方法和加入的辅料对马钱素含量有一定影响，其炮制品 中马钱素含量相对于生品均有所降低，且以清蒸品含量最低。马钱素含量降低的原因可能 是马钱素属于环烯醚萜苷类，在一定条件下易发生水解，炮制加热和加入辅料对其能产生 一定影响的缘故。 3.3 据药理作用研究表明，山茱萸具有免疫调节、抗炎、抗休克、降糖、强心作用， 其不同成分具有不同的免疫药理活性［4］。其中熊果酸体外具有一定的促进免疫效应， 并有抑菌、安定、降温和抗糖尿病等作用［1］；马钱素在低浓度(0.016 ｍｇ/ｍｌ)时有 促进淋巴细胞转化作用而高浓度(0.500 ｍｇ/ｍｌ)时则有抑制作用,提示马钱素对免疫反应 有双向调节作用［5］。本研究以马钱素作为山茱萸不同样品的考察指标，正是以其药理 作用为依据的，山茱萸炮制前后马钱素含量的变化，对其药理作用肯定有影响，其具体量 效关系有待于进一步研究。 【摘要】目的研究消水散治疗结核性胸水的机制。方法运用灌胃给药途径观察其对小 鼠在促进结核性胸水的消退、抗慢性增生性炎症中的作用及其对小鼠胸腺、脾脏的重量和 血清溶血素水平的影响。结果该制剂具有良好的加速结核性胸水的消退及一定的抗慢性炎 症作用，并可增强机体的免疫功能。结论消水散对结核性胸水的治疗作用主要在于能加速 消水、抗炎及增强免疫功能。 【关键词】消水散；药效学 Abstract： ObjectiveTostudythetreatmentmechanismofXiaoshuipowderontuberculouspleu risy.MethodsToobservetheeffectsofXiaoshuipowderonpromotingextinctionoftu berculouspleuralfluidofMusmusculusalbuswiththeadministrationrouteoflavage ，counteractingChronichyperplasticinflammation,andintheirweightofthymusgl andandspleenofmouse,aswellasthelevelofserumalhemolysin.ResultsXiaoshuip owdercouldpromoteextinctionoftuberculouspleuralfluidandcounteractChronich yperplasticinflammationandreinforceimmunefunction.ConclusionXiaoshuipowd ercanspeeduptheextinctionoffluidandresistinflammatoryandreinforceimmunef unction. Keywords：Xiaoshuipowder；Pharmacodynamics 消水散是在老中医经验方(生黄芪、丹参、枸杞子、百部等)的基础上加减并经现代工 艺研制而成的散剂,具有利水消肿、养阴健脾的功效,用于结核性胸水的治疗有较好的临床 效果。为进一步阐明该药的治疗机理,笔者按卫生部中药新药研究指南［1］的基本要求对 其进行了药效学研究。现报道如下。 1 器材 1.1 药物消水散(山东省中医药大学附属医院药剂科提供,每毫升相当于含有生药 1.5g)、呋噻米注射液(泗水希尔康制药有限公司生产,批号 0307021),玉屏风颗粒(广东环 球制药有限公司,批号 050902),琼脂（青岛海洋化工厂，批号 031104），XS-225A 电子 天平(瑞士 Precisa 公司生产)，结核分枝杆菌菌株:用我院传代的标准人型结核菌株 H37Rv 在改良罗氏培养基上培养 3 周,刮取菌落,用电子秤称重量。研磨匀浆后用生理盐水 稀释制成每毫升含菌量 0.03mg 的悬液备用。 1.2 仪器 UA-2100 型分光光度计（尤尼柯仪器有限公司生产），DZKW-C 型恒温水 浴（黄晔市卸甲电器厂），DL-5-B 型离心机（上海安亭科学仪器厂）。 1.3 动物昆明系小鼠(由山东大学动物实验中心提供,鲁动质字 D20040923)。实验动 物购入后在实验室条件下适应性饲养一周后在大鼠右侧腹股沟内侧备皮、消毒,卡介苗 (BCG)悬液 0.1ml(0.06mg)皮内注射。BCG 为上海生物制品研究所生产,批号 S20013038。 2 方法 2.1 动物模型的制备 健康小鼠 100 只，体重 20～23g，雄雌各半，按体重性别随机均分为 5 组，其中 3 组灌胃不同剂量的消水散，0.2ml/10g，1 次/d，连续 7d。对照组、呋噻米组同时灌胃等 容量生理盐水。实验第 8 天实验前 1h，给呋噻米组动物灌服呋噻米。小鼠于接种 BCG 后 5 周作胸腔穿刺术。先胸部备皮,用地西泮注射液 0.3ml/只肌肉注射,5min 后以 5 号针头 从右侧肋弓角顶点紧贴剑突侧缘作胸腔穿刺,约进针 0.5cm 后注入结核分枝杆菌悬液 1ml, 第 2 天以顺利抽出胸腔积液为模型建立成功。实验时将各组动物用苦味酸标记、称重。胸 腔内注入后第 2，5，10，15，20 天处死小鼠。每只大鼠肌肉注射地西泮溶液 0.4ml 后, 剪开腹部皮肤,腹主动脉放血至死。然后用剪刀从剑突处沿胸骨剪开皮肤和胸骨,暴露双侧 胸腔。观察胸腔积液在胸内的分布收集、记录胸腔积液量。注射后每隔 2h 用电子天平称 量动物体重 1 次并记录，连续 4 次。 2.2 消水散抗慢性增生性炎症实验［2，3］取健康小鼠 100 只，体重 20～23g，雄 雌各半，按体重性别随机均分为 5 组；分别灌喂生理盐水、不同剂量的消水散以及玉屏风 颗粒，0.2m1/10g，1 次/d，连续 13d。实验第 1 天动物均右侧腋窝皮下注射 2%琼脂 0.5ml／只。实验第只。实验第 14 天，将动物脱颈椎处死，仔细剖取皮下琼脂块，用精密电子分析天 平称量其湿重。 2.3 消水散对幼鼠胸腺、脾脏重量的影响［2，3］健康小鼠 100 只，体重 13～ 15g，雄雌各半，按体重性别随机均分为 5 组；分别灌胃生理盐水、不同剂量的消水散以 及玉屏风颗粒，0.2ml／只。实验第10g，1 次/d，连续 7d。实验第 8 天，将动物脱颈椎处死，仔细 剖取动物胸腺、脾脏，置入 Bounis 中固定 24h，仔细剔除附着的结缔组织，分析天平称 重，计算胸腺、脾脏重量系数(mg／只。实验第10g 组织)。 2.4 消水散对小鼠血清溶血素水平的影响［2，3］健康小鼠 100 只，体重 13～ 15g，雄雌各半，按体重性别随机均分为 5 组；分别灌胃生理盐水、不同剂量的消水散以 及玉屏风颗粒，0.2ml／只。实验第10g，1 次/d，连续 7 实验第 1 天动物均腹腔注射 5％鸡红细胞液 0.2ml／只。实验第只刺激动物免疫。实验第 8 天,摘 取动物眼球取血(不加抗凝剂)，离心 3000r／只。实验第min，10min；所得血清用生理盐水稀释 100 倍；取稀释血清 lml，加入 5％鸡红细胞液 0.5ml，10％补体 0.5ml，混匀；在 37℃水浴温育 30min，0℃冰水终止反应。将上述液体离心，3000r／只。实验第min，10min；取 上清液于分光光度计 540nm 处测定吸光度(OD 值)，以 OD 值大小反映血清溶血素水平的 高低。 2.5 实验数据处理采用 SASS8.0 统计软件进行处理。 3 结果 3.1 消水散促进结核性胸水消退情况结果见表 1。胸腔镜和胸膜活检的病理发现 50% ～80%的结核性胸膜炎患者其胸膜有典型的结核结节,提示结核分枝杆菌直接侵袭胸膜引起 胸膜炎症并产生胸腔积液［4］,这成为胸腔内注入结核分枝杆菌以建立结核性胸膜炎的动 物模型的依据。本研究采用减毒活结核分枝杆菌直接注入大鼠的胸腔内,试图建立结核性胸 膜炎并发胸腔积液的实验性动物模型,再给小鼠分别灌胃消水散、盐水及呋噻米后，以观察 其对胸水消退的程度。实验结果显示，消水散 3 种剂量均可加速结核性胸水的消退 (P<0.05)；其中以小剂量的消水散效应稍微优于其它两种剂量。表 1 消水散促进结核性胸 水消退实验结果(略) 3.2 消水散抗慢性增生性炎症情况结果见表 2。3 种剂量的消水散均具有一定的抗慢性 炎症作用；小剂量的消水散抗炎效应与对照组比较可见显著性差异(P<0．05)。该实验与 上述实验均未呈现消水散的量-效关系，出现该现象的原因不清，可能与中药方药具有最适 治疗剂量有关。表 2 消水散抗慢性增生性炎症实验结果(略) 3.3 消水散对幼鼠胸腺、脾脏重量的影响结果见表 3。在有关免疫功能实验中，可以 观察到连续给动物灌服消水散，可以增加幼小动物胸腺、脾脏的重量系数；在增加胸腺重 量系数方面，大、中剂量的消水散与对照组比较可见显著性差异(P＜0.05)；在增加脾脏 重量系数方面，3 种剂量的消水散有一定作用趋势；这表明消水散可以增强机体非特异性 免疫功能。表 3 消水散对幼鼠胸腺、脾脏重量的影响(略) 3.4 消水散对小鼠血清溶血素水平的影响结果见表 4。血清溶血素水平测定结果显示， 消水散可提高血清溶血素水平，中剂量消水散作用更加显著，意味其具有体液免疫增强功 能。表 4 消水散对小鼠血清溶血素水平影响实验结果(略) 4 讨论 近年来，结核病疫情在世界范围内呈现回升趋势,结核性胸膜炎的发病率也有所增加。 结核性胸膜炎是临床常见病，是结核分支杆菌及其代谢产物进入高敏状态的机体胸膜所引