北五味子多糖提取论文

【摘要】目的建立提取和测定北五味子中多糖含量的方法。方法采用比色法测定北五 味子中多糖含量。结果测得北五味子中多糖含量为 6.57%，平均回收率为 99.78%，RSD=1.54%。结论该方法简便、精密度及重现性均较好，结果令人满意。 【关键词】北五味子多糖提取含量测定 ExtractionandDeterminationofPolysaccharidefromSchisandrachinensis(Tur cz)BaillFruit Abstract： ObjectiveToestablishamethodfortheextractionanddeteminationofpolysaccharid efromSchisandrachinensis(Turcz)BaillFruit.MethodsPolysaccharideinSchisandr achinensis(Turcz)BaillFruitwasdeterminedbythemethodofSpectrophotometry.R esultsThepolysacharidesinSchisandrachinenisis(Turcz)BaillFruitwas6.57%,thea veragerecoverywas99.78%,RSDwas1.54%.ConclusionThismethodissimple，th eresultisstable，reproducible,andsatisfactory. Keywords：Schisandrachinensis(Turcz)Baill； Polysaccharide;Extraction;Determination 北五味子 Schisandrachinensis(Turcz）BaillFruit 是木兰科植物五味子的干燥成熟 果实，是著名的滋补性中药，因其果实甘、酸、辛、苦、咸五味俱全，故名五味子，具有 敛肺、滋肾、生津、收汗、涩精之功效。现代药理研究证实五味子对中枢神经系统、呼吸 系统均有兴奋作用，亦能促进肝糖原异生，加快肝糖原分解，在治疗神经衰弱、肝炎等的 药物中应用十分广泛。五味子有南北之分，据《本草纲目》记载“五味子南产者红，北产者 黑，入滋补药，必用北者为良”，北五味子的化学成分主要为五味子木脂素、挥发油、五味 子醇、多糖等［1］。近年来对多糖提取工艺的研究方法很多，如热水浸提法、稀碱液浸 提法、稀酸液浸提法。但多糖是由单糖基通过糖苷键连接而成的化合物，在稀酸、稀碱条 件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因此本文 采用热水浸提法，用苯酚-硫酸法测定北五味子多糖的含量，得到满意的结果。 1 仪器与药品 北五味子购于张家口市药材公司经鉴定为北五味子，其它试剂均为国产分析纯； UV752752752 分光光度计（上海第三仪器厂）；GOA 型电热真空干燥箱（天津东郊机械加工 厂）；RE75252A 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。 2 方法与结果 2.1 葡萄糖储备液的配制精密称取 105℃干燥至恒重的葡萄糖 100mg，用蒸馏水溶 解并定容到 100ml。 2.2 苯酚溶液的配制取苯酚 100g，加铝片 0.1g 和 NaHCO30.05g，蒸馏，收集 182℃馏份，称取 7.5g，加水 150ml 溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。 2.3 测定条件选择 2.3.1 反应温度选择精密吸取葡萄糖储备液 1.0ml 于 100ml 容量瓶中，用水稀释至刻 度，作为对照品溶液。分别吸取葡萄糖对照品液 1.0ml 于两个具塞试管中，各加苯酚液 1.0ml，并分别迅速滴加浓硫酸 5.0ml。另取两份 1.0ml 水同上操作，为空白液。一份于 水浴中煮沸 15min，另一份于 40℃水浴中恒温 30min 取出，冷却至室温，15min 后于 490nm 处测其吸光度值，分别为 0.112 和 0.126。因此，本实验采用 40℃恒温 30min 的方法。 2.3.2 苯酚及硫酸用量选择吸取葡萄糖对照品液 1.0ml5 份，分别加入苯酚液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分别加水至 2.0ml，再各滴加浓硫酸 5.0ml，40℃恒温 30min 后，测其吸光度值，分别为 0.095，0.112，0.125，0.127，0.126，可见加入 苯酚液 0.6ml 以上时，反应都能完成；另取葡萄糖对照品液 1.0ml5 份，分别加苯酚液 1.0ml，再分别滴加浓硫酸 2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml，并均用水稀释至 8.0ml，加入 硫酸体积占总体积的 62.5%以上时的结果较满意。 2.3.3 反应时间选择及稳定性取葡萄糖对照品溶液 1.0ml3 份，各加苯酚液 1.0ml， 浓硫酸 5.0ml，于 40℃分别恒温 20，30，40min。测得吸光度值分别为 0.16，0.125，0.126，可见加热 30min 即可使反应完全。另测反应完成后样品在不同时 间内的吸光度值，结果 3h 内稳定。 2.4 标准曲线绘制精密量取葡萄糖标准溶液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ml 置具 塞试管中，分别加蒸馏水使成 1.0ml，再分别加入苯酚溶液 1.0ml，摇匀，然后加浓硫酸 5.0ml，充分摇匀，于 40℃水浴中恒温 30min，取出，冷却至室温，另以蒸馏水同上操 作为空白对照，在 490nm 处测定吸光度，绘制标准曲线，建立回归方程： A=0.06781C+0.00620471，r=0.9998。 2.5 精密度实验精密吸取对照品溶液 1.0ml，6 份，同 2.4 项下操作，结果显示吸光 度的 RSD=1.45%。 2.6 多糖的提取流程北五味子粉碎后，称取 500g，用清水洗净，加水 4500ml，微沸 煎煮 1h。过滤，滤渣加水 2000ml，煎煮 1h，过滤，合并提取液，加热浓缩至 300ml。 加入乙醇使乙醇含量为 80%放置 12h，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤，得到 棕色粗多糖。将粗多糖溶于水，用 seveg 法除去蛋白，加入 1%活性碳脱色，抽滤，滤液 加入乙醇，使溶液含醇达 80%，静置过夜，抽滤，残渣用无水乙醇、丙酮反复洗涤，真空 干燥，即得精制北五味子多糖。 2.7 换算因子测定 精确称取 60℃干燥恒重的五味子多糖 20mg，加水溶解后定容到 100ml 容量瓶中， 摇匀，作为多糖储备液精确量取多糖储备液 0.2ml，加水至 1.0ml 按测量标准曲线同样的 方法测其吸光度值，根据标准曲线计算浓度。按下式计算换算因子：f=W/CD 式中：W 为 多糖重量（μgg），C 为测试液中据标准曲线方程计算得到的单糖浓度（μgg·ml-1）D 为多 糖的稀释因子，测得 f=1.748，（n=6）。 2.8 样品含量的测定 准确称取干燥五味子粉末 100mg，3 份，分别置于索氏提取器中，用 80%乙醇回流 提取 1h，改用水微沸煎煮，3 份分别煎煮 1，2，3 次，各定容至 100ml，为样品液。分 别精密吸取上述样品液 10ml，分别定容至 100ml，各取 1.0ml，按 2.4 项下操作，平行 做 6 次，并按下式计算多糖含量（以粗多糖计）。结果见表 1。表明提取两次即可。多糖 含量（%）=CDf/W×100。式中：C 为样品溶液的葡萄糖的浓度（μgg·ml-1），D 为样品 溶液的稀释因子，f 为换算因子，W 为样品的重量（μgg）。表 1 样品中多糖的含量（略） 2.9 回收率测定精密吸取样品液 0.5ml（6 份）再分别精密加入不同量的标准溶液， 依样品测定方法测定吸光度，计算回收率平均值为 99.78%，RSD=1.54%。 3 讨论 3.1 苯酚752 硫酸比色法是测定多糖含量较经典有效的方法之一，但各自的报道中，对反应温度的 控制、试剂中苯酚及硫酸用量不尽相同。常见的反应温度有煮沸、40℃恒温和室温 3 种， 鉴于冬天和夏天室温相差较大，本实验仅比较于前两种条件，证实本法以 40℃恒温 30min 较好。加入苯酚量 0.6ml 以上时，反应能完成。对于硫酸的用量，经实验对比认 为硫酸占总体积 62.5%以上时，在重现性、稳定性及回收率方面都有明显的优越性，并且 与文献报道一致［2］。 3.2 实验结果表明，北五味子多糖提取两次即可，平均含量为 6.57%，比文献报道的 稍低［3］，这可能与北五味子的产地、采收季节等因素有关。 3.3 五味子粗多糖的初步药理研究表明［4］，五味子粗多糖能明显提高小鼠的耐缺氧 能力，具有抗疲劳作用，亦能使正常小鼠胸腺和脾脏的重量的增加。说明五味子粗多糖能 够提高机体对环境的适应能力和防御能力。而北五味子多糖含量较高，这可能是北方五味 子药效较优的原因之一，但是北五味子多糖的结构组成和生理活性有待进一步研究。 【摘要】目的为充分利用马鞭草植物资源，避免资源的浪费，探讨马鞭草总黄酮的提 取及鉴别方法。方法采用超声波乙醇浸提法从马鞭草中提取黄酮类物质，对所提取的黄酮 类物质进行验证，并用分光光度法测定含量。结果测得样品中总黄酮的含量 C=0.2028mg/ml，回收率为 101.4%，其纯度和产率均较高。结论该方法采用全物理过 程，无任何污染，是提取马鞭草黄酮类物质的有效途径。 【关键词】超声波提取马鞭草总黄酮鉴别 TheTotalFlavanoneofHerbaV752erbenaeExtractionandtheIdentificationbyUltra sonicWave Abstract： ObjectiveTomakeuseoftheresourcesofherbaverbenae,avoidwastingandapproac htheextractionoftotalflavanoneofherbaverbenae.MethodsTheflavonoidswereex tractedbyethanolasthesolventfromHerbaV752erbenaewithultrasonicwaveandetha nolextraction.UsingspectrophotometrytoextractandchecktheflavanoneofHerba V752erbenae.ResultsThedensityofthetotalflavanoneofherbaverbenaewasC=0.202 8mg/ mlandtherateofrecoverywas101.4%.Ttheoutcomeandthepurityoftheflavanone wereallveryhigh.ConclusionThismethodisapurelyphysicalprocessandhasnotany pollution.ItisanidealwaytoextracttheflavanoneofHerbaV752erbenae. Keywords：Ultrasonicwavetreatment；Herbaverbenae；Totalflavanone； Identification 马鞭草 Herbaverbenae 始载于《名医别录》，为马鞭草科植物马鞭草 V752erbenaoficinalisL．的全草，广泛分布于我国中南、西南及山西、甘肃、新疆、江苏和的全草，广泛分布于我国中南、西南及山西、甘肃、新疆、江苏和 浙江等地［1］。马鞭草性苦、辛，微寒，具有清热解毒、活血通经、利水消肿、截疟的 功效，用于感冒发热、黄疸、痢疾、痛经、水肿、疟疾、跌打损伤等［1］。其主治癥瘕 积聚、经闭痛经、疟疾、喉痹、痈肿、水肿、热淋等症，可用于治疗疟疾、白喉、传染性 肝炎、流行性感冒、丝虫病、咳嗽等［2］。马鞭草亦可利尿，止血，促进泌尿系统结石 的排出，减少黏膜出血，缓解疼痛，配合其它常用利水通淋化石的中药，临床常获良效 ［3］。除此之外，其外用可治疗痔疮、关节痛、跌打损伤、水疝等［4，5］。马鞭草含 有鞭草苷、5752二氢马鞭草苷、桃叶珊瑚苷、熊果酸、3α，24752二羟基齐墩果酸、十六酸、 β752谷甾醇、羽扇豆醇、蒿黄素、β752胡萝卜素等化学成分［2］。由于其在临床应用中有明 显的疗效，近年又发现有新的药理活性，现代研究又发现马鞭草醇提取物具有抗生育、抗 癌作用［1］。因此马鞭草中的化学成分及药效物质引起了新的关注。马鞭草由于临床应 用无毒副作用，前景具有潜在优势，对其研究受到重视。 近年来，超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的 毒质等研究已有报道［6，7］，表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。很 多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等， 可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并 且还可避免高温对提取成分的影响［7］。但超声技术应用于提取马鞭草中黄酮类物质的 研究尚未见报道，本文报道用超声波提取马鞭草总黄酮及鉴别。 1 仪器与试剂 1.1 仪器 KQ5200DB 型数控超声波清洗器（超声工作频率 40kHz、昆山市超声仪器 有限公司）；UV752752755B 紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂）；ZF752I 型三用紫外分 析仪(上海顾村光电仪器厂)；SHB752III 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。 1.2 试剂 95%乙醇；亚硝酸钠 AR；硝酸铝 AR；氢氧化钠 AR；三氯化铝 AR；盐酸 AR；氨水 AR；乙酸镁 AR；镁粉 AR；正丁醇 AR；冰醋酸 AR；醋酸乙酯 AR；芦丁标准 品（中国药品生物制品检定所）；新鲜马鞭草购自广西百色市人民菜市。 2 方法与结果 2.1 总黄酮成分提取取新鲜马鞭草，烘干，粉碎。称取马鞭草粉末约 6g，加 80ml95%乙醇，超声波提取 2.5h，抽滤。滤渣再加 80ml95%乙醇，超声波提取 2.5h， 抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩 25ml 左右为止，放置 250ml 容量瓶中， 用 60%乙醇稀释至刻度，得样品液。 2.2 测定方法依据以芦丁为对照品测定马鞭草中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同 时控制适宜 pH 值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收 峰。 2.3 定量实验-总黄酮的含量测定 2.3.1 波长的选择 取样品液适量，在 0.30ml5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以 试剂为空白参比液在 420～700nm 波长范围测定络合物的吸光度，络合物于 510nm 波 长处有最大吸收，故测定时选用此波长。 2.3.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取芦丁对照液（0.10mg/ ml）0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00ml 于 10.00ml 容量瓶中，分别加 入 5%亚硝酸钠溶液 0.30ml，摇匀，静置 6min；再加 10%硝酸铝溶液 0.30ml，摇匀， 静置 6min；再加 4%氢氧化钠溶液 4.00ml，用 60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置 12min，以试剂作空白参比液，于 510nm 处测吸光度。结果见表 1。表 1 紫外可见分光 光度计测定芦丁对照液吸光度（略） 根据上表得回归方程：A=-0.03110+13.52C，r=0.9999。 2.3.3 提取物含量的测定精密吸取样品液 0.50ml，置 10ml 容量瓶，按标准曲线的制 备方法测定吸光度 A=0.106，根据回归方程：A=-0.03110+13.52C，计算样品中总黄 酮的含量 C=0.2028mg/ml。 2.3.4 回收实验精密量取样品液 2.00ml，加入标准芦丁对照品 2.00ml（0.10mg/ ml），同前样品测定方法操作测定吸光度，求出回收率为 101.4%。 2.4 定性实验-总黄酮的鉴别 2.4.1 颜色反应 紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈 灰褐色并有荧光斑点。 浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏 30s，立即在紫外光下 观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。 三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加 1％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见 光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。 乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加 1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈 黄色斑点。 盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液 1ml 于试管中加镁粉，再加入浓盐酸数滴（一次加 入），在泡沫处呈紫红色。 2.4.2 纸层析取样品溶液 10μgl 点在滤纸上。用正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5（体积比）为展 开剂，上行展开 5h，取出晾干。喷 1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑 点。 3 讨论 3.1 实验结果表明，本实验方法工艺简单，回收率为 101.4%，提取效率高于传统方 法，利用本文所提供的超声波提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高。超声波可 以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的，此方法采用全物理过程，无任何污染， 是一条理想的提取黄酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。 3.2 黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分， 具有很高的药用价值。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异 黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等［8］。天然来源的生物黄