凉燥致病机制探究论文

【摘要】目的研究凉燥对小鼠的主要致病机制。方法 216 只无特定病原体级（SPF） 昆明小鼠随机分为常温常湿组（A 组），常温燥组（B 组），凉燥组（C 组），每组 72 只。 在模拟凉燥条件下造模，第 7 天与第 14 天检测气道与皮肤组织病理、气管纤毛运动、气 道液分泌（RS）与气道液 IgG 抗体（IgGRR）、血液流变学、细菌攻击实验与气管细胞 bcl-2 基因、bax 基因表达。结果与 A 组相比，C 组第 14 天气管、肺与皮肤病变明显，肺 细菌数增高，IgGRR 增高，第 7 天 RS 降低（P<0.01），血液流变学影响不明显，但气管 细胞 bcl-2 基因表达下降。结论凉燥伤肺、伤津，致气道“纤毛-黏液毯”局部御邪屏障受损； 肺津凝滞于肺，以致宣输失司则皮肤失养。本结果为凉燥致病提供实验资料。 【关键词】凉燥致病机制 Abstract：ObjectiveToinvestigatethepathogeniceffectsofCoolDryonmice.Methods216Kunmingmice(SPF)weredividedintothreegroupsincludin ggroupA(normalmice),groupB(normaltemperatureandOuterRDrymice),groupC( Cool-Drymice),72mice/ group.RespiratorysecretionofMucopolysacchride(RS),IgGofRespiratory(IgGRR) ，hemorrheology，BacterialattackingandExpressionofbclR2，baxgeneweretest edinday7and14.ResultsIngroupCthepathologrealchangesofrespiratoryandskins wereobvious,andbacilliaquantityoflungincreased,bclR2geneexpressionwasredu cedsignificantlycomparedwithgroupA(P<0.01).ConclusionIthasfirstprovidedthe evidencesofCoolRDrythatinjuredthewindpipeandskinsandthedefencedof“lanket ofCilla-mucus”andreducedtheexpressionofbcl2gene,whichwasrelatedtothemechanismsofCoolRDry. Keywords：Cool-Dry;Pathogenicmechanism 燥气清冷肃降，肃杀收引，“燥气先伤于华盖”，易伤津液。“秋深初凉，西风肃杀，感 之者，多病风燥，此属燥凉，较严冬风寒为轻。”外燥有温燥与凉燥之分，但未见凉燥病机 系统性实验研究报道。在相关研究中证实外燥致小鼠气道病变的基础上［1］，本文研究 凉燥及相兼细菌攻击对小鼠气管纤毛运动、气道液分泌与气道液 IgG 抗体、血液流变学及 气管细胞 bclR2 基因，bax 基因表达等影响，为阐析凉燥致病机制提供资料。 1 材料与方法 1.1 动物 无特定病原体级（SPF）昆明种小鼠 216 只，体重（18±1）g，雌雄各半，湖北省实 验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2003-2005。 1.2 仪器与试剂 LRH250R250 人工智能气候箱（温度：（30～65±1）℃，相对湿度：（30～90）% ±5%，广东医疗器械厂），XSJDRD 恒温倒置显微镜（重庆显微镜厂），CS501 超级恒温 器（重庆实验仪器厂），756MC 紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）， FASCOR全自动血液流变仪（重庆南方医疗设备公司）。咔唑（批号：054K078，Sigma 公司），D-葡萄糖醛酸内酯（批号：2711EC，Sigma 公司），四硼酸钠与台氏液试剂、 10%甲醛、H250E 染料（分析纯，批号：050108）上海精细化工科技有限公司。TUNEL 试 剂盒（MK1020，2005R03）、bclR2 兔抗鼠 IgG 多抗（BA0412，2005R03）、bax 兔 抗鼠 IgG 多抗（BA0315，2005R03）和阳性对照片由武汉博士德生物工程有限公司提供。 1.3 菌株 金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC25923，北京天坛生物制品公司)。 1.4 方法 1.4.1 动物模型及分组 216 只昆明小鼠随机分为常温常湿组、常温燥组、凉燥组，每组 72 只，分批置人工 气候箱内、用昆明种小鼠饲料常规饲养。按表 1 模拟外燥“温度R相对湿度R风”条件进行造模。 各组第 7 天和第 14 天进行检测前 4h 禁食、禁水。表 1 各组小鼠“温度－相对湿度－风”处 理条件（略） 1.4.2 病理组织学观察 断颈处死小鼠，常规取气管 1.5cm，右肺组织（中）（40±10）mg/只、背部皮肤 （0.5cm×0.5cm）及左足垫皮肤，H250E 染色、镜检。 1.4.3 气管上皮纤毛运动实验（CiliamovementofTrachealEpithelium,CM,min/ mm）：按文献方法［2］。 1.4.4 气道液黏多糖（RespiratorysecretionofMucopolysacchride,RS,μg/mlg/ml）测 定：咔唑比色法，参考文献方法［2］。 1.4.5 气道液 IgG（IgG-R）检测 常规气管插管，取灌洗液分离上清，按酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒说明书检 测。以包被液作空白对照，PBSpH2507.4（10%小牛血清）作阴性对照。每份样品检测 3 次， 记录标本均值与阴性对照（P/N）倍数之平均值。 1.4.6 血液流变学检测［3］ 受血液流变仪对血量标本的限制，每组取 9 只小鼠眼球血合为 1 份标本进行测试，3 份/组。肝素抗凝管取眼球血，4h 内测定血浆黏度、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数。 1.4.7 细菌攻击实验 取培养 18h 金黄色葡萄球菌，经标准比浊法配成细菌悬液（1×108cfu/ml），各组 小鼠于第 7 天经鼻常规滴种金黄色葡萄球菌 0.1ml/只，24h 后重复 1 次。接种细菌第 6 天无菌取小鼠右肺（40±10）mg/只常规检测肺细菌数 （BacilliaQuantity,BQ，1×106cfu/g 取均值），以及 RS 与 IgGRR［4］。 1.4.8 气管细胞凋亡检测 第 14 天取气管切片，按脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL） 试剂盒程序操作。结果判断：气管上皮细胞核内出现棕黄色颗粒为 TUNEL 染色阳性。镜 下随机计数 200 个细胞，计算： 细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数 200×100% 1.4.9 气管细胞 bcl-2 基因，bax 基因表达检测第 14 天常规取气管标本切片、按试剂 盒说明书操作。结果判断：气管上皮细胞浆内出现棕黄色颗粒为 bcl-2（或 bax）表达阳 性。镜下计数 500 个细胞，计算： 阳性指数（PI）=阳性细胞数记数细胞数×100% 1.4.10 统计学处理 实验数据以±s 表示，采用 SPSS13.0 软件，资料之间比较用 ANOVA 分析，显着性 检验采用多个样本均数间 q 检验（Newman-Keuls 法）；各组第 7 天与第 14 天比较用 t 检验，P<0.05 认为差异有统计学意义，检验水准为双侧 α=0.05。 2 结果 2.1 气管、肺结构观察常温常湿组第 7、第 14 天气管上皮结构完整、纤毛整齐，气管 腺体、细支气管与肺泡未见异常，背部皮肤结构完整，毛球数多，新生毛干数丰富且层次 清晰，足垫皮肤汗腺丰富。常温燥组第 14 天部分气管纤毛倒伏、黏连，肺泡轻度淤血， 皮肤未见异常；凉燥组第 14 天气管上皮鳞状化生，气管纤毛多呈灶状缺损，≤20%气管 浆液腺上皮黏液腺化生，肺部淤血、水肿明显，均较第 7 天严重；背部皮肤无明显异常， 但足垫部皮肤腺体明显减少与皮下结缔组织增生。 2.2 凉燥对气管上皮纤毛运动（CM）、气道液黏多糖（RS）与 IgGRR 的影响结果见 表 2。表 2 凉燥对小鼠气管纤毛运动、气道液黏多糖与 IgG-R 的影响(略) 2.3 凉燥对小鼠血液流变学的影响见表 3。与常温常湿组比较，凉燥组血液流变学指 标改变无显著性。表 3 凉燥对小鼠血液黏度的影响(略) 2.4 凉燥相兼细菌攻击对小鼠肺细菌数（BQ）、呼吸道液黏多糖（RS）与 IgG-R 的 影响见表 4。表 4 细菌攻击对凉燥小鼠 BQ、RS 与 IgG-R 的影响（略） 2.5 凉燥对气管细胞凋亡与 bcl-2 基因、bax 基因表达的影响见表 5。表 5 凉燥对小 鼠气管上皮细胞 bcl-2、bax 基因表达与细胞凋亡的影响(略) 3 讨论 按表 1 条件处理，病理检查可见凉燥组第 14 天气管上皮鳞状化生与炎性细胞浸润， 气管纤毛多呈灶状缺损，肺泡充血、水肿明显，表明凉燥伤肺、伤津，肺失其濡养而致组 织细胞结构受损；≤20%气管浆液腺上皮黏液腺化生，提示与凉燥肺津生成障碍相关；足 垫皮肤汗腺明显减少与结缔组织增生等，表明肺宣输失司、皮毛腠理失之濡润，合以卫表 不固，致“燥气先伤于华盖”。本结果为凉燥致病提供组织学证据。 气道液内含黏蛋白（主为黏多糖和蛋白质），覆盖于黏膜表面形成黏液毯，是气道的 重要保护性屏障之一；RS 与气道液分泌呈正相关，其主要作用是湿润气道黏膜、保护上皮 的纤毛运动。与常温常湿组比较，凉燥组第 7 天 RS 减少，显示凉燥早期气道液分泌严重 减少而具“干”之特点。值得注意的是凉燥组第 14 天 RS 明显增多（P<0.01），其机理可 能是凉燥之邪的凉气可伤肺阳而致肺津不化、凝聚成痰饮，故气道液明显增加。气道纤毛 受“凉凝”之气道液刺激而病理性运动加快。凉燥组细菌攻击后 RS 明显减少，也提示生物病 原攻击可加重气道分泌障碍与“正气”受损［5］。IgG-R 是气道重要免疫防御成分之一，凉 燥组第 7～14 天以及细菌攻击后 RS 增高，与机体的保护性反应有关。凉燥相兼细菌攻击， 外则卫滞邪郁，内则津少气虚，抗邪无力则病邪入里；肺津不化则凝成痰饮，细菌及其毒 素可加重肺津生成障碍与宣输失司更甚，加之气道局部御邪屏障受损则对生物病原攻击的 敏感性增高，但故凉燥组肺细菌数是常温常湿组的 7.1 倍，结果提示凉燥病机之一与损伤 气道分泌与“纤毛-黏液毯”有关。凉燥组血液黏度变化不明显，但红细胞刚性指数增高，提 示血液运行障碍，其机理有待研究。 bcl-2 属于低丰度表达基因，编码的 bcl-2/bax 家族蛋白如 bcl-2/bax 二聚体为抑制 细胞凋亡构型，bax/bax 二聚体可诱导细胞凋亡。结果显示，常温常湿组与凉燥组气管细 胞凋亡率均较低（≤0.3%），但凉燥组气管 bcl-2 阳性细胞多见于气管纤毛缺损或鳞状上 皮化生处，提示与凉燥致病机制相关。 结果表明，凉燥主要病机可能是：凉燥伤津，凉燥之邪的凉气可伤肺阳而致肺津不化， 凝集成痰饮，合以宣输失司，皮毛腠理失养而致卫表不固；肺津生成锐减，气道“纤毛-黏 液毯”生物防御屏障受损，合以对生物病原攻击敏感性增加等综合因素致病。凉燥致气管细 胞 bcl-2 基因表达下调与凉燥致病机制的相关性值得研究。 【摘要】目的为木槿 H250ibiscussyriacusL.的质量评价标准提供科学资料。方法生药学 鉴定法。结果描述木槿叶片和粉末的性状特征及显微特征。结论木槿叶的性状特征和显微 特征可用于鉴别该生药。 【关键词】木槿叶生药学 Abstract:ObjectiveToprovideascientificbasisforqualitystandardofH250ibiscussy riacusL..MethodsPharmacognosticidentificationwasused.ResultsWedescribedth emacroscopiccharacteristicsoftheleaves，powderandmicroscopiccharacteristic sofH250ibiscussyriacusL.ConclusionThemacroscopicandmicroscopiccharacteristics canbeusedforitsidentification. Keywords:H250ibiscussyriacusL.；Leaves；Pharmacognosy 木槿 H250ibiscussyriacusL.原植物为锦葵科落叶灌木,木槿之名在《尔雅》中已有记载。 《中国药典》（1977 年版）将木槿花 H250.syriacusL.收载入药，并对其性状和功效进行了 介绍。木槿全身是宝，木槿的花、果实、叶和皮均可入药。花、叶入药：清热凉血，解毒 消肿；果实入药：清肺化痰，解毒止痛；茎皮、根皮入药：清热祛湿、杀虫止痒。 Lee 等［1］从木槿中分离到皂草苷(saponarin)、紫杉叶素 3-O-葡萄吡喃糖、芹菜 素 7-O-葡萄吡喃糖和 3 个结构已知的异黄酮 6"-O-acetyldaidzein、6"-Oacetylgenistin 和 3-O-hydroxydaidzein。这 3 个异黄酮成分能显著抑制鼠肝微粒体脂 质过氧化。李朝阳等［2］对木槿叶的营养成分进行了分析测定，结果发现木槿叶中的蛋 白质、脂肪、维生素 C、糖、粗纤维的含量较高。 木槿叶有一定的去污能力，我国古代妇女每逢七巧节就有用木槿叶洗发的习惯，是一 种很好的纯植物性且具保健作用的洗发剂［3］。木槿叶中含大量人体所需的营养成分与 无机元素。李朝阳等［2］测定，木槿叶中蛋白质含量高达 3.72%，脂肪含量达 0.79%， 粗纤维含量达 9.83%，糖类含量达 6.27%，还富含人体必需的微量元素，如钙、镁、铁、 锌等。木槿的嫩叶可做汤还可泡茶，具有较高的药用价值［4］。 本实验将对木槿的叶片进行生药学研究，为进一步研究和开发利用木槿这一丰富的植 物资源提供依据。 1 器材 1.1 药材木槿叶采于长沙市森林公园，经湖南省药检所主任药师方石林鉴定为植物木 槿 H250ibiscussyriacusL.的叶。 1.2 仪器 XSZ-H250 型显微镜（COIC 重庆光学仪器厂）；FW-80 型高速万能粉碎机（天 津市泰斯特仪器有限公司）。 1.3 试剂水合氯醛，甘油。 2 方法 2.1 表面撕离装片将木槿叶上、下表皮进行表面撕离装片。 2.2 粉末制片法取叶的干燥药材粉碎成细粉（过 4 号筛），装瓶，贴上标签。制备粉 末时，注意取样的代表性。干燥时，一般温度不得超过 60℃，以免淀粉粒糊化。 2.3 组织切片采用徒手切片法切片将木槿叶进行横切后装片。 3 结果 3.1 性状鉴别叶片为卵形或菱状卵形，互生，长 4～7cm，宽 2～4cm，不裂或中部 以上 3 裂，基部楔形，边缘有钝齿，幼时两面均疏生星状毛。叶背除脉上有毛外，其余平 滑无毛。 3.2 显微特征 3.2.1 上表皮表皮细胞为长方形或不规则形的扁平细胞，内含众多草酸钙簇晶，直径 15～36μg/mlm，少数含有草酸钙方晶，直径 8～25μg/mlm。单细胞非腺毛基部钝圆，顶部锐尖 或稍钝，长 480～650μg/mlm，直径 15～33μg/mlm，壁厚 3～8μg/mlm，表面光滑，有的胞腔内含 黄棕色物。腺毛头部由多个细胞组成，直径 12～23μg/mlm，柄单细胞而短。偶见气孔，平轴 式，保卫细胞肾形，副卫细胞 3～6 个。见图 1。 3.2.2 下表皮表皮细胞长方形，排列紧密，壁明显比上表皮细胞壁厚。单细胞非腺毛 狭长，长 440～1100μg/mlm。腺毛头部由多个细胞组成，直径 12～25μg/mlm，柄单细胞而短。 有众多气孔，明显比上表皮多，大多为平轴式，少数为不定式，保卫细胞肾形，副卫细胞 3～6 个。表皮细胞及副卫细胞中含有众多草酸钙簇晶，直径 15～38μg/mlm，少数细胞中含 有草酸钙方晶，直径 9～25μg/mlm。见图 2。 3.2.3 横切面上表皮细胞长方形，以内是厚角组织和薄壁组织。下表皮细胞较小，具 气孔。下表皮细胞有多数凹陷，可见腺毛和单细胞非腺毛。叶肉栅栏组织 1～2 层细胞， 排列紧密，海绵组织 4～6 层细胞，排列亦相对紧密，维管束外韧型，位于叶脉中央，其 上方是具成串导管的木质部，下方是韧皮部，在木质部与韧皮部之间有不发达的形成层； 维管束下方为发达的薄壁组织，薄壁细胞中含有簇晶状草酸钙结晶，紧贴下表皮分布有 3 ～5 层厚角细胞。见图 3。 3.2.4 粉末深绿色。单细胞非腺毛基部钝圆，顶部锐尖或稍钝，长 480～1150μg/mlm， 直径 25～43μg/mlm，壁厚 3～8μg/mlm，有的胞腔内含黄棕色物，大多数表面光滑，有的可见条 状纹理或细小疣状突起。草酸钙簇晶众多，大多分布在叶肉或表皮细胞中，直径 21～ 56μg/mlm，也可见草酸钙方晶，8～25μg/mlm。导管多数为螺纹导管，直径 15～44μg/mlm，少数 为网纹导管，直 15～45μg/mlm。纤维多成束，有的与导管连结。见图 4。