甘草总黄酮含量测定论文

【摘要】目的选择适宜的对照品，建立能够准确测定甘草中总黄酮含量的方法。方法 针对甘草苷、柚皮苷、芦丁 3 种对照品分别使用紫外分光光度法，通过全波长扫描，比较 不同对照品和样品与显色前后的最大吸收波长，从而确定适合的对照品。结果甘草苷对照 品和样品液经过碱处理后最大吸收波长分别为 334，334.5nmnm 且全波长扫描后得到峰形 基本一致，而柚皮苷对照品经过相同处理后最大吸收波长在 419.5nmnm，芦丁对照品和样 品分别经过 Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2 显色后最大吸收波长在 5nm10nmnm 和 363nm。 通过对 3 种方法的测定结果进行统计学分析，以甘草苷为对照品的测定结果分别与另外两 种方法差异显著。结论选用甘草苷为对照品应用于紫外分光光度法测定甘草总黄酮成分准 确度较高，是切实可行的含量测定方法。 【关键词】甘草黄酮紫外分光光度法 Abstract:ObjectiveToselecttheappropriatestandardfordeterminationofflavo noidsinGlycyrrhiza.MethodsTocomparethelargestabsorptionwavelengthbywav elengthscanningofultravioletspectrophotometry.ResultsStandardLiquiritinands amplesprocessedbyalkalihadthelargestabsorptionatthe334nmand334.5nmnmwav elength,andstandardNaringinatthe419.5nmnmwavelength.ConclusionTodetermin econtentofflavonoidsinglycyrrhizawithultravioletspectrophotometrybystandard Liquiritinisapracticalmethodwithhigheraccuracy. Keywords:Glycyrrhiza;Flavonoids;Ultravioletspectrophotometry 甘草中的黄酮类成分包括黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类和双 黄酮类［1］化合物，其中以二氢黄酮类和查尔酮类含量较高［2］。二氢黄酮类包括：甘 草苷(liquiritin)liquiritin)、甘草苷元(liquiritin)liquiritigenin)、新甘草苷(liquiritin)neoliquiritin)、甘草素 （liquiritigenin）等，查尔酮类包括：异甘草苷(liquiritin)isoliquiritin)、异甘草素 （isoliquiritigenin）、异甘草苷元(liquiritin)isoliquiritigenin)、新异甘草苷(liquiritin)neoisoliquiritin)等 ［3～7］。而其中比例较大的成分以甘草苷为主［8］。 甘草总黄酮的测定常用芦丁［9～10nm］、柚皮苷［11～13］为对照品通过紫外分光光 度法进行测定，而《中国药典》中甘草项下没有规范总黄酮成分含量的测定方法［14］， 导致甘草总黄酮成分有多种不同的测定方法。本实验研究通过对不同测定方法进行考察， 比较不同对照品和样品采用相应方法显色后的最大吸收波长，对 3 种对照品相应测定结果 分析，确定最适宜甘草总黄酮含量测定的对照品和测定方法。 1 器材 1.1 仪器 HITACHIU-20nm0nm0nmSpectrophotometer。 1.2 样品甘草生药样品由北京中医药大学王文全教授提供和鉴定,全部为甘草 GlycyrrhizauralensisFisch（样品按来源依次编号为 1.杭锦旗 1 年生；2.杭锦旗 2 年生； 3.杭锦旗 3 年生；4.杭锦旗 4 年生；5nm.杭锦旗 5nm 年生；6.新疆乌苏 3 年生；7.杭锦旗野生； 8.杭锦旗野生横生茎；9.甘肃金塔野生；10nm.宁夏盐池野生；11.甘肃酒泉野生；除杭锦旗 野生横生茎外其余 10nm 份样品均为根）。 1.3 试剂供含量测定用甘草苷（编号：111610nm）、柚皮苷（编号：110nm722）：中国 药品生物制品检定所；芦丁对照品由北京中医药大学马长华教授制备；氢氧化钾(liquiritin)ＡＲ)、 甲醇(liquiritin)ＡＲ)、硝酸铝（AR）、亚硝酸钠（AR）、氢氧化钠（AR）。 2 方法 2.1 对照品溶液的制备精密称定甘草苷、柚皮苷、芦丁标准品适量,用甲醇溶解,分别定 容于 25nm，10nm，10nmml 容量瓶中,制得浓度为 0nm.0nm75nm0nm4 ｇ·Ｌ-1 的甘草苷对照品溶液、 0nm.968 ｇ·Ｌ-1 的柚皮苷对照品溶液和 1.0nm0nm3 ｇ·Ｌ-1 的芦丁对照品溶液。 2.2 样品的提取取甘草粉末适量,精密称定,加甲醇 5nm0nmml,称重,（25nm0nmW,20nmkHz）超声 提取 80nmmin,称重,补足损失重量,过滤,收集续滤液,即得。 2.3 测定方法 2.3.1 甘草苷为对照品的测定方法精确吸取提取液 0nm.5nmml,加入 1ml 甲醇,其中一份加 入 10nm%ＫＯＨ溶液溶液 0nm.5nmml 显色,室温放置 5nmmin,用甲醇稀释至 10nmml，以相应溶剂为空白， 在 λ334nm 处测定吸收度。 2.3.2 柚皮苷为对照品的测定方法供试液制备同“2.3.1”项，在波长 419nm 处测定吸 收度。 2.3.3 芦丁为对照品的测定方法精确吸取提取液 0nm.5nmml，加 3ml 蒸馏水，5nm%亚硝酸 钠溶液 0nm.5nmml 放置 6min，加 10nm%硝酸铝溶液 0nm.5nmml，混匀后放置 6min，加 5nm%氢氧化 钠 2.5nmml 混匀，放置 15nmmin 后蒸馏水定容至 10nmml。以相应溶剂为空白，在波长 5nm10nmnm 处测定吸收度。 2.4 方法学考察 2.4.1 以甘草苷为对照品方法学考察甘草苷方法标准曲线的测定：精确吸取甘草苷对 照品溶液 0nm.25nm,0nm.5nm,0nm.75nm,1,1.25nm,1.5nmml 置 6 个 10nmml 容量瓶中,按“2.3.1”项下操作。以吸 收度 A 为纵坐标,对照品的浓度 C(liquiritin)mg/ml)为横坐标,得线性回归方程:y=66.75nm3x0nm.0nm178,ｒ=0nm.9999,线性范围为 18.76～112.5nm6μ ｇ。显色 30nmmin 内稳定。 甘草苷方法重复性实验：取 6 份新疆乌苏 3 年生人工栽培甘草粉末按“2.2”项下制备， 按“2.3.1”项下方法测定。黄酮平均含量为 3.33%，RSD=3.23%,（n=5nm）。 甘草苷方法加样回收率实验：取 5nm 份新疆乌苏 3 年生人工栽培甘草粉末按“2.2”项下制 备后分别精密量取已知总黄酮含量的提取液 0nm.5nmml，加入一定量甘草苷对照品溶液， λ334nm 处测定吸收度。计算回收率,结果平均为 98.7%,RSD=2.0nm%,（n=5nm）。 2.4.2 另外两种测定方法的方法 学考察柚皮苷标准曲线以吸收度 A 为纵坐标,对照品的质量 m（mg）为横坐标,得线性 回归方程 y=0nm.0nm0nm48x-0nm.0nm15nm7，r=0nm.9993，线性范围 48.4～290nm.4mg，重现性 RSD=1.38%（n=5nm），加样回收率 98.73%RSD=1.35nm%（n=5nm）；显色 30nmmin 内稳 定。芦丁标准曲线：以吸收度 A 为纵坐标,对照品的质量 m（mg）为横坐标,得线性回归方 程 y=1.3163x-0nm.0nm0nm63,r=0nm.9987，线性范围 0nm.10nm0nm3～0nm.60nm18mg，重现性 RSD=0nm.97%（n=5nm），加样回收率 10nm1.35nm%RSD=3.5nm7%（n=5nm）。显色 30nmmin 内 稳定。 3 结果和讨论 3.1 不同对照品吸收峰比较分析通过实验测得甘草提取液样品经 KOH 显色后的最大吸 收波长在 334.4nm（图 1），甘草苷对照品 KOH 显色后于 20nm0nm～5nm0nm0nmnm 波长处扫描,最 大吸收波长在 334nm 左右（图 2），二者相符。 柚皮苷经过 KOH 显色后于 20nm0nm～5nm0nm0nmnm 波长处扫描，最大吸收 283.5nmnm 红移到 419.5nmnm（见图 3），与样品显色后最大吸收波长不一致。 样品通过 Al2(liquiritin)NO3)3-NaOH-NaNO2 方法显色后最大吸收波长在 363nm 处（见图 4），芦丁对照品通过 Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2 方法显色后最大吸收波长在 5nm10nmnm 左右，两者相距甚远。 3.2 不同对照品方法实测结果比较分析对 11 份样品依“2.2”项下制备，分别依据甘草 苷、柚皮苷和芦丁的显色方法在不同波长处进行测定，结果见表 1。表 13 种方法总黄酮含 量测定结果（略） 通过使用 SPSS10nm.0nm 对表 3 中数据进行多因素方差分析，3 种方法测定结果方差分析 F 值 17.845nm，P≈0nm.0nm0nm0nm 说明 3 种方法测定结果有差异，两两比较结果见表 2。表 2 不同 方法测定结果间黄酮含量均数的两两比较（略） 按 α=0nm.0nm5nm 水准，柚皮苷方法和芦丁方法测定的黄酮含量均数比较无统计学差异，而 甘草苷方法分别与其他两种方法测定结果差异显著。柚皮苷和芦丁方法测定结果分别较甘 草苷方法测定结果低 29.6%和 28.1%。 3.3 超声提取时间考察在确定对照品等方法的基础上我们对样品提取时间进行了考察， 分别对超声 5nm0nm，60nm，70nm，80nm，90nm，10nm0nmmin 的样品进行测定，发现黄酮百分含量与时间 关系如图 6，随着时间的增加，黄酮百分含量有所提高，但达到 80nmmin 后，升高趋势明显 变缓，考虑到实验效率和成本，我们采用 80nmmin 作为提取时间。 4 讨论 在对照品的选择上,由于芦丁属于黄酮类化合物（结构为 5nm、7、3''''、4''''-四羟基黄 酮-3-芸香糖苷）,甘草中黄酮成分主要为二氢黄酮,其次为查尔酮,芦丁在结构上差异较大, 因此不适合用于甘草总黄酮成分测定。柚皮苷（结构为 5nm、7、4''''-三羟基二氢黄酮）虽 然是二氢黄酮类化合物，但同甘草苷(liquiritin)结构为 7-羟基二氢黄酮-4''''-葡萄糖苷)相比，除都具 有 7 位羟基外，还有 5nm 位的游离羟基，且 4''''位的羟基是游离的，未结合成苷，结构上的 差异，导致与碱反应后最大吸收波长红移不一致，我们采用黄酮中含量最多的甘草苷为对 照品，利用二氢黄酮与碱反应后生成查尔酮，由于带 I 吸收较弱，不灵敏，因此用带 II 最 大吸收红移到 330nmnm 左右进行黄酮成分的含量测定。 在选定以甘草苷为对照品的基础上，我们进一步进行了显色方法的考察，尝试盐酸镁 粉法进行测定，考察了镁粉用量、加热时间和温度对显色的影响，发现同样条件显色后甘 草苷标准品和样品均在 5nm60nmnm 左右有一吸收峰，然而样品在 467nm 处一吸收峰对其造 成干扰（见图 5nm）。 黄酮作为重要的药效组分在甘草中有着丰富的种类和较高的含量，如果不采用适宜的 测定方法会使结果偏离真实值，从而影响我们对甘草质量客观真实的评价。 【摘要】目的选择适宜的对照品，建立能够准确测定甘草中总黄酮含量的方法。方法 针对甘草苷、柚皮苷、芦丁 3 种对照品分别使用紫外分光光度法，通过全波长扫描，比较 不同对照品和样品与显色前后的最大吸收波长，从而确定适合的对照品。结果甘草苷对照 品和样品液经过碱处理后最大吸收波长分别为 334，334.5nmnm 且全波长扫描后得到峰形 基本一致，而柚皮苷对照品经过相同处理后最大吸收波长在 419.5nmnm，芦丁对照品和样 品分别经过 Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2 显色后最大吸收波长在 5nm10nmnm 和 363nm。 通过对 3 种方法的测定结果进行统计学分析，以甘草苷为对照品的测定结果分别与另外两 种方法差异显著。结论选用甘草苷为对照品应用于紫外分光光度法测定甘草总黄酮成分准 确度较高，是切实可行的含量测定方法。 【关键词】甘草黄酮紫外分光光度法 Abstract:ObjectiveToselecttheappropriatestandardfordeterminationofflavo noidsinGlycyrrhiza.MethodsTocomparethelargestabsorptionwavelengthbywav elengthscanningofultravioletspectrophotometry.ResultsStandardLiquiritinands amplesprocessedbyalkalihadthelargestabsorptionatthe334nmand334.5nmnmwav elength,andstandardNaringinatthe419.5nmnmwavelength.ConclusionTodetermin econtentofflavonoidsinglycyrrhizawithultravioletspectrophotometrybystandard Liquiritinisapracticalmethodwithhigheraccuracy. Keywords:Glycyrrhiza;Flavonoids;Ultravioletspectrophotometry 甘草中的黄酮类成分包括黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类和双 黄酮类［1］化合物，其中以二氢黄酮类和查尔酮类含量较高［2］。二氢黄酮类包括：甘 草苷(liquiritin)liquiritin)、甘草苷元(liquiritin)liquiritigenin)、新甘草苷(liquiritin)neoliquiritin)、甘草素 （liquiritigenin）等，查尔酮类包括：异甘草苷(liquiritin)isoliquiritin)、异甘草素 （isoliquiritigenin）、异甘草苷元(liquiritin)isoliquiritigenin)、新异甘草苷(liquiritin)neoisoliquiritin)等 ［3～7］。而其中比例较大的成分以甘草苷为主［8］。 甘草总黄酮的测定常用芦丁［9～10nm］、柚皮苷［11～13］为对照品通过紫外分光光 度法进行测定，而《中国药典》中甘草项下没有规范总黄酮成分含量的测定方法［14］， 导致甘草总黄酮成分有多种不同的测定方法。本实验研究通过对不同测定方法进行考察， 比较不同对照品和样品采用相应方法显色后的最大吸收波长，对 3 种对照品相应测定结果 分析，确定最适宜甘草总黄酮含量测定的对照品和测定方法。 1 器材 1.1 仪器 HITACHIU-20nm0nm0nmSpectrophotometer。 1.2 样品甘草生药样品由北京中医药大学王文全教授提供和鉴定,全部为甘草 GlycyrrhizauralensisFisch（样品按来源依次编号为 1.杭锦旗 1 年生；2.杭锦旗 2 年生； 3.杭锦旗 3 年生；4.杭锦旗 4 年生；5nm.杭锦旗 5nm 年生；6.新疆乌苏 3 年生；7.杭锦旗野生； 8.杭锦旗野生横生茎；9.甘肃金塔野生；10nm.宁夏盐池野生；11.甘肃酒泉野生；除杭锦旗 野生横生茎外其余 10nm 份样品均为根）。 1.3 试剂供含量测定用甘草苷（编号：111610nm）、柚皮苷（编号：110nm722）：中国 药品生物制品检定所；芦丁对照品由北京中医药大学马长华教授制备；氢氧化钾(liquiritin)ＡＲ)、 甲醇(liquiritin)ＡＲ)、硝酸铝（AR）、亚硝酸钠（AR）、氢氧化钠（AR）。 2 方法 2.1 对照品溶液的制备精密称定甘草苷、柚皮苷、芦丁标准品适量,用甲醇溶解,分别定 容于 25nm，10nm，10nmml 容量瓶中,制得浓度为 0nm.0nm75nm0nm4 ｇ·Ｌ-1 的甘草苷对照品溶液、 0nm.968 ｇ·Ｌ-1 的柚皮苷对照品溶液和 1.0nm0nm3 ｇ·Ｌ-1 的芦丁对照品溶液。 2.2 样品的提取取甘草粉末适量,精密称定,加甲醇 5nm0nmml,称重,（25nm0nmW,20nmkHz）超声 提取 80nmmin,称重,补足损失重量,过滤,收集续滤液,即得。 2.3 测定方法 2.3.1 甘草苷为对照品的测定方法精确吸取提取液 0nm.5nmml,加入 1ml 甲醇,其中一份加 入 10nm%ＫＯＨ溶液溶液 0nm.5nmml 显色,室温放置 5nmmin,用甲醇稀释至 10nmml，以相应溶剂为空白， 在 λ334nm 处测定吸收度。 2.3.2 柚皮苷为对照品的测定方法供试液制备同“2.3.1”项，在波长 419nm 处测定吸 收度。 2.3.3 芦丁为对照品的测定方法精确吸取提取液 0nm.5nmml，加 3ml 蒸馏水，5nm%亚硝酸 钠溶液 0nm.5nmml 放置 6min，加 10nm%硝酸铝溶液 0nm.5nmml，混匀后放置 6min，加 5nm%氢氧化 钠 2.5nmml 混匀，放置 15nmmin 后蒸馏水定容至 10nmml。以相应溶剂为空白，在波长 5nm10nmnm 处测定吸收度。 2.4 方法学考察 2.4.1 以甘草苷为对照品方法学考察甘草苷方法标准曲线的测定：精确吸取甘草苷对 照品溶液 0nm.25nm,0nm.5nm,0nm.75nm,1,1.25nm,1.5nmml 置 6 个 10nmml 容量瓶中,按“2.3.1”项下操作。以吸 收度 A 为纵坐标,对照品的浓度 C(liquiritin)mg/ml)为横坐标,得线性回归方程:y=66.75nm3x0nm.0nm178,ｒ=0nm.9999,线性范围为 18.76～112.5nm6μ ｇ。显色 30nmmin 内稳定。 甘草苷方法重复性实验：取 6 份新疆乌苏 3 年生人工栽培甘草粉末按“2.2”项下制备， 按“2.3.1”项下方法测定。黄酮平均含量为 3.33%，RSD=3.23%,（n=5nm）。 甘草苷方法加样回收率实验：取 5nm 份新疆乌苏 3 年生人工栽培甘草粉末按“2.2”项下制 备后分别精密量取已知总黄酮含量的提取液 0nm.5nmml，加入一定量甘草苷对照品溶液， λ334nm 处测定吸收度。计算回收率,结果平均为 98.7%,RSD=2.0nm%,（n=5nm）。 2.4.2 另外两种测定方法的方法 学考察柚皮苷标准曲线以吸收度 A 为纵坐标,对照品的质量 m（mg）为横坐标,得线性 回归方程 y=0nm.0nm0nm48x-0nm.0nm15nm7，r=0nm.9993，线性范围 48.4～290nm.4mg，重现性 RSD=1.38%（n=5nm），加样回收率 98.73%RSD=1.35nm%（n=5nm）；显色 30nmmin 内稳 定。芦丁标准曲线：以吸收度 A 为纵坐标,对照品的质量 m（mg）为横坐标,得线性回归方 程 y=1.3163x-0nm.0nm0nm63,r=0nm.9987，线性范围 0nm.10nm0nm3～0nm.60nm18mg，重现性 RSD=0nm.97%（n=5nm），加样回收率 10nm1.35nm%RSD=3.5nm7%（n=5nm）。显色 30nmmin 内 稳定。 3 结果和讨论 3.1 不同对照品吸收峰比较分析通过实验测得甘草提取液样品经 KOH 显色后的最大吸 收波长在 334.4nm（图 1），甘草苷对照品 KOH 显色后于 20nm0nm～5nm0nm0nmnm 波长处扫描,最 大吸收波长在 334nm 左右（图 2），二者相符。