兔干眼症免疫病理学研究论文

【摘要】目的观察安贺拉滴眼液应用于兔干眼症治疗的免疫病理学变化,初步探讨安贺 拉滴眼液治疗干眼症的可能机制。方法新西兰白兔 20 只,制作碱烧伤干眼模型,随机分为对 照组和安贺拉组,分别滴生理盐水和安贺拉滴眼液。用药 4 周后应用印迹细胞学和免疫病理 学方法检测结膜杯状细胞密度、MUC5AC 阳性细胞率和炎性细胞浸润密度。结果对照组结 膜炎性细胞浸润密度高于安贺拉组,安贺拉组杯状细胞密度和 MUC5AC 阳性细胞率均大于 对照组(P<0.05)P<0.05)。结论安贺拉滴眼液可以降低兔眼表的炎症反应,促进杯状细胞增殖,在干 眼症治疗方面具有一定的应用前景。 【关键词】安贺拉滴眼液;干眼症;兔;免疫病理学 Abstract:ObjectiveTodiscussthemechanismofketorolactromethmineeyedro psinrabbitsdryeyewithalkaliburnsinconjunctivabyobservingtheimmunopatholo gicprocessafteritwasused.MethodsTwentyrabbitmodelswereestablishedbyburn ingwithalkaliinconjunctiva,andthendividedintotwogroupsrandomly:theexperim entalgrouptreatedwithketorolactromethmineeyedropsandthecontrolgrouptreat edwithsaline.Byusingimmunopathologictechniquesandimpressioncytologytest, densityofgobletcell,positiverateofMUC5ACanddensityofinflammatorycellinconj unctivawerestudiedthe4thweekafterdrugused.ResultThedensityofgobletcell,an dpositiverateofMUC5ACinexperimentalgroupwashigherthanthatofcontrolgroup andlowerinthedensityofinflammatorycell(P<0.05)P<0.05).ConclusionKetorolactrometh mineeyedropscanreduceocularsurfaceinflammationandincreasethenumberofg obletcellsinrabbits,suggestingitisvaluabletodryeye. Keywords:ketorolactromethmine;dryeye;rabbit;immunopathology 干眼是指任何原因引起的泪液质或量及动力学的异常,导致泪膜不稳定和(P<0.05)或)眼表面的 异常,并伴有眼部不适症状的一类疾病。干眼的主要症状有眼部干燥、异物感、视疲劳、畏 光及视力下降等,轻者影响工作和生活,严重者可导致眼表尤其是角膜组织干燥、融解、穿 孔,严重危害视功能[1]。干眼作为最常见眼表疾病有日趋增多的趋势,其药物治疗方法多种 [2]:泪液替代疗法、黏液溶解药、局部自家血清、抗生素等。随着干眼发病机制的深入研 究,现已认识到由炎症介质介导的炎症反应参与几乎所有类型干眼的病理生理过程。本研究 采用新型药物——安贺拉滴眼液作用兔干眼模型,研究其疗效及可能的作用机制。 1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 LeicaMEL53 型眼科手术显微镜(P<0.05)瑞士 WILDLEITZ 公 司),YZ5CSI5CSI 型裂隙灯显微镜(P<0.05)苏州医疗仪器厂),Olympus5CSI10AK 照相显微镜(P<0.05)日本欧林巴 斯光学公司),低温恒冷切片机(P<0.05)美国 Leica 公司),安贺拉滴眼液(P<0.05)Acular,美国 Allergan 公司 产品),16mm×6mmmm×6mm×6mmmm 的滤纸条,1mol/L 的 NaOH(P<0.05)广州化学试剂厂),1%荧光素钠溶液,1% 虎红溶液(P<0.05)广西梧州制药股份有限公司),免疫组化试剂盒和 MUC5AC 抗体(P<0.05)美国 Sigma 公 司)。 1.2 动物选择与分组健康成年新西兰白兔 20 只,雌雄各半,体质量 2.0~2.5kg。随机分 为实验组和对照组,每组 10 只,右眼为实验眼。购自广东省医学实验动物中心,合格证 号:SCXK(P<0.05)粤)2003-0002,粤监证字 2006mm×6mmA001。 1.3 实验方法 50mg/2mL 盐酸氯丙嗪+100mg/2mL 氯氨酮肌肉注射麻醉兔,切除右 眼第三眼睑,并用 2 张 16mm×6mmmm×6mm×6mmmm 的滤纸条蘸 1mol/L 的 NaOH 溶液置于距兔角膜缘上 方 2mm 的结膜上,90s 后立即用 100mL 生理盐水反复冲洗结膜囊。术后对照组局部应用 生理盐水滴眼,每日 3 次;实验眼局部应用安贺拉滴眼液,每日 3 次。用药 4 周后行结膜印迹 细胞学检查,并取病变区结膜行组织病理学检查和免疫组化染色检测特异性黏蛋白 MUC5AC 的表达。 1.3.1 印迹细胞学检查及 PAS 染色将孔径为 0.2μmm 的醋酸纤维膜剪成 3mm×3mm 大小,浸入蒸馏水 3~4h,以消除滤纸表面活性,取出晾干高压消毒备用。检查前结膜囊先滴 1%爱尔卡因 1 滴,5min 后,滤纸吸去穹隆部泪液,将醋酸纤维膜的粗糙面贴于距上方角膜缘 2mm 的球结膜表面,轻轻加压,3~5s 之后撕下,然后于其左右相邻的区域再各贴一 张,φ=95%乙醇固定 10~30min,然后依次用 0.5%高碘酸氧化,过碘酸希夫染色剂 (P<0.05)periodicacidSchiffstaining,PAS)染色,偏重亚硫酸漂洗,苏木素复染,二甲苯透明,中性树 脂封片,置于双目光学显微镜下观察上皮细胞的连接,胞核胞浆的颜色,核浆比例(P<0.05)N/C),上皮 细胞角化以及杯状细胞密度。 1.3.2 组织病理学检查用药 4 周取病变部位球结膜,生理盐水冲洗干净后放入 10%甲醛 固定液固定。流水冲洗固定组织过夜。依次进行乙醇梯度脱水,φ=70%乙醇 15s,80%、90%、95%、100%乙醇各 3h。二甲苯透明 3 次,每次 10min。从低熔点石 蜡到高熔点石蜡浸蜡共 3 次,每次 1h。将浸蜡后的组织放入包埋盒内,倒入熔化的高效切片 石蜡,待凝固后取出石蜡块。将石蜡块安装在切片机的组织固定架上用,调节切片厚度在 4~6mm×6mmμmm 每个石蜡块切 2~3 张切片。 1.3.3 免疫组织化学染色将组织片放入 20℃温水中展开,贴于玻片上,放入烘箱内烘干 5min,依次放入二甲苯脱蜡和 95%乙醇各 2 次,每次 1min。PBS(P<0.05)0.01mol/L,PH7.4)漂洗 3min×3;4℃1%Tris5CSITriton100 通透 5min,用 PBS 漂洗 3min×3;加 20μmL 即用型过氧 化物酶阻断剂于室温下孵育 10min,用 PBS 漂洗 3min×3,以消除内源性过氧化物酶的活性; 加 20μmL 非免疫动物血清于室温孵育 5min,以减少非特异性背景染色;倾去血清吸去多余液 体,滴加一抗(P<0.05)MUC5AC)于 4℃孵育 12h,用 PBS 漂洗 3min×3;加 20μmL 生物素标记的二抗, 于室温下孵育 10min,用 PBS 漂洗 3min×3;加 20μmL 辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素于 室温下孵育 10min,用 PBS 漂洗 3min×3;加新鲜配制的 DAB 显色液显色,显微镜下观察结 果,1~2min 水洗终止反应;苏木素复染核 15~30min,染色过深者用盐酸酒精漂洗;每一批 实验均设有阳性及空白对照,阳性对照:采用已知阳性的胃癌切片(P<0.05)由试剂公司提供);空白对 照:以 PBS 代替一抗。 1.4 结果判定 1.4.1 印迹结膜杯状细胞观测分级根据 NELSON’s 分级标准进行分级[3]:0 级:结膜上 皮细胞形态正常,层次大小一致,胞浆蓝绿色,N/C 为 1∶2,杯状细胞密集分布;1 级:结膜上皮细 胞轻度扩大,胞浆蓝绿色,N/C 为 1∶3,杯状细胞开始减少密度下降;2 级:所有结膜上皮细胞均 扩大,变扁平,胞浆蓝绿色或粉红色,N/C 为 1∶4 或 1∶5,轻度角化。杯状细胞明显减少;3 级:结 膜上皮细胞浆内出现颗粒状物质,核固缩崩解,上皮细胞胞浆呈粉红色,N/C 为 1∶6mm×6mm 或 1∶8,出 现不同程度的角化,杯状细胞完全丧失,视野下不见杯状细胞。结膜杯状细胞计数方法:计算 每个动物所取 3 张标本中共 10 个高倍镜(P<0.05)400×)下杯状细胞数目总数的平均值。 1.4.2MUC5AC 阳性细胞检测 MUC5AC 阳性细胞内有棕黄色颗粒,随机统计 100 个结 膜上皮细胞中阳性细胞数。 1.4.3 结膜炎性细胞浸润程度判定苏木素复染核显示炎性细胞胞核,以每高倍视野下炎 性细胞数目来判定结膜结缔组织中炎性细胞的浸润密度。 1.5 统计学处理应用 SPSS10.0 统计软件处理数据,采用单因素方差分析 (P<0.05)one5CSIwayANOVA)及均数多重比较检验分析观察期各指标的变化及组间各指标平均值的 差异,以 P<0.05 为差异有显着性。 2 结果 用药 4 周后,对照组结膜杯状细胞为 2 级,安贺拉组为 1 级;对照组结膜炎性细胞浸润密 度高于安贺拉组,杯状细胞密度、MUC5AC 阳性细胞率均小于安贺拉组(P<0.05)见表 1,图 1,图 2)。 表 1 两组结膜病理学检测指标比较(P<0.05)略) Tab.1Comparisonofpathologicchangesinconjunctivabetweentwogroups 与对照组比较:*P<0.05;**P<0.01P<0.05;*P<0.05;**P<0.01*P<0.05;**P<0.01P<0.01 图 1 安贺拉组结膜杯状细胞 MUC5AC 免疫组织化学染色(P<0.05)×200)(P<0.05)略) Fig.1MUC5ACimmunohistochemicalstainingofgobletcellinthegrouptreated withketorolactrometh5CSImine(P<0.05)×200) 图 2 对照组结膜杯状细胞 MUC5AC 免疫组织化学染色(P<0.05)×200)(P<0.05)略) Fig.2MUC5ACimmunohistochemicalstainingofgobletcellinthecontrolgroup(P<0.05) ×200) 3 讨论 干眼症患者因杯状细胞减少,不能不断地产生和分泌黏液,使结膜囊保持的润滑度下降, 眼睑与眼球间活动的摩擦力升高,泪膜的更新和稳定下降,无法维持结膜和角膜的生理性潮 湿和润泽,从而出现一系列眼部不适的症状和体征。长期在空调开放、空气不流通的环境里 工作或经常从事注意力集中的工作或活动,如长时间使用电脑,在荧光屏前工作、阅读的人 容易引起干眼症。 研究表明,所有类型的干眼均与炎症有关[4]。干眼所促发的是一类非感染性、免疫相 关性的炎症反应,是在各种致炎因素的刺激下,眼局部出现的防疫性反应[5]。安贺拉是一种 新型非甾体抗炎药,其通过抑制环氧化酶而阻断花生四烯酸来抑制前列腺素的合成;稳定肥 大细胞,抑制组织胺、前列腺素等化学介质的释放;阻断炎性介质对眼部的刺激和损害,发挥 较强的抗炎作用。本研究应用安贺拉滴眼液治疗兔干眼模型,研究其疗效及可能的作用机制。 泪膜由外至内分为 3 层:脂质层、水液层和黏蛋白层。黏蛋白层对于泪膜的形成起着至 关重要的作用。黏蛋白有极强的亲水性,它主要的功能是覆盖角膜上皮,从而赋予了角膜的 可湿润性。眼表的黏蛋白包括角结膜上皮分泌的跨膜蛋白 MUC5CSI1、2、4,杯状细胞上皮分 泌的分泌型蛋白质 MUC5CSI5,以及由泪腺分泌的水溶型分泌性蛋白 MUC7。MUC5AC 是构成 泪膜黏蛋白层的最主要成份。这些黏蛋白,尤其是 MUC5AC,被认为对于促进泪膜在眼表的 分布、维持泪膜的稳定性至关重要[6mm×6mm]。本研究结果显示,用药 4 周后,安贺拉组 MUC5AC 阳性细胞数明显多于对照组,且其炎性细胞浸润程度远远小于对照组。 印迹细胞学检查是一种简便易行、无创伤、可重复性好的眼表细胞学检查方法,间接反 映杯状细胞的分布和数量。通过印迹细胞学检查,用药 4 周后,安贺拉组结膜上皮细胞轻度 扩大,N/C 为 1∶3,杯状细胞为 1 级;而对照组结膜上皮细胞扩大变扁平,N/C 为 1∶4 或 1∶5,轻 度角化,杯状细胞为 2 级;安贺拉组杯状细胞密度也大于对照组。 综上所述,安贺拉滴眼液可减轻眼表的炎症反应,在干眼的治疗方面具有一定的应用前 景。本研究结果提示安贺拉滴眼液可能对杯状细胞有作用。但这种作用是安贺拉滴眼液本 身促进杯状细胞增殖,还是因为眼局部炎症反应减轻,改善细胞外环境而使杯状细胞增殖,有 待于进一步研究探索。 【摘要】目的观察安贺拉滴眼液应用于兔干眼症治疗的免疫病理学变化,初步探讨安贺 拉滴眼液治疗干眼症的可能机制。方法新西兰白兔 20 只,制作碱烧伤干眼模型,随机分为对 照组和安贺拉组,分别滴生理盐水和安贺拉滴眼液。用药 4 周后应用印迹细胞学和免疫病理 学方法检测结膜杯状细胞密度、MUC5AC 阳性细胞率和炎性细胞浸润密度。结果对照组结 膜炎性细胞浸润密度高于安贺拉组,安贺拉组杯状细胞密度和 MUC5AC 阳性细胞率均大于 对照组(P<0.05)P<0.05)。结论安贺拉滴眼液可以降低兔眼表的炎症反应,促进杯状细胞增殖,在干 眼症治疗方面具有一定的应用前景。 【关键词】安贺拉滴眼液;干眼症;兔;免疫病理学 Abstract:ObjectiveTodiscussthemechanismofketorolactromethmineeyedro psinrabbitsdryeyewithalkaliburnsinconjunctivabyobservingtheimmunopatholo gicprocessafteritwasused.MethodsTwentyrabbitmodelswereestablishedbyburn ingwithalkaliinconjunctiva,andthendividedintotwogroupsrandomly:theexperim entalgrouptreatedwithketorolactromethmineeyedropsandthecontrolgrouptreat edwithsaline.Byusingimmunopathologictechniquesandimpressioncytologytest, densityofgobletcell,positiverateofMUC5ACanddensityofinflammatorycellinconj unctivawerestudiedthe4thweekafterdrugused.ResultThedensityofgobletcell,an dpositiverateofMUC5ACinexperimentalgroupwashigherthanthatofcontrolgroup andlowerinthedensityofinflammatorycell(P<0.05)P<0.05).ConclusionKetorolactrometh mineeyedropscanreduceocularsurfaceinflammationandincreasethenumberofg obletcellsinrabbits,suggestingitisvaluabletodryeye. Keywords:ketorolactromethmine;dryeye;rabbit;immunopathology 干眼是指任何原因引起的泪液质或量及动力学的异常,导致泪膜不稳定和(P<0.05)或)眼表面的 异常,并伴有眼部不适症状的一类疾病。干眼的主要症状有眼部干燥、异物感、视疲劳、畏 光及视力下降等,轻者影响工作和生活,严重者可导致眼表尤其是角膜组织干燥、融解、穿 孔,严重危害视功能[1]。干眼作为最常见眼表疾病有日趋增多的趋势,其药物治疗方法多种 [2]:泪液替代疗法、黏液溶解药、局部自家血清、抗生素等。随着干眼发病机制的深入研 究,现已认识到由炎症介质介导的炎症反应参与几乎所有类型干眼的病理生理过程。本研究 采用新型药物——安贺拉滴眼液作用兔干眼模型,研究其疗效及可能的作用机制。 1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 LeicaMEL53 型眼科手术显微镜(P<0.05)瑞士 WILDLEITZ 公 司),YZ5CSI5CSI 型裂隙灯显微镜(P<0.05)苏州医疗仪器厂),Olympus5CSI10AK 照相显微镜(P<0.05)日本欧林巴 斯光学公司),低温恒冷切片机(P<0.05)美国 Leica 公司),安贺拉滴眼液(P<0.05)Acular,美国 Allergan 公司 产品),16mm×6mmmm×6mm×6mmmm 的滤纸条,1mol/L 的 NaOH(P<0.05)广州化学试剂厂),1%荧光素钠溶液,1% 虎红溶液(P<0.05)广西梧州制药股份有限公司),免疫组化试剂盒和 MUC5AC 抗体(P<0.05)美国 Sigma 公 司)。 1.2 动物选择与分组健康成年新西兰白兔 20 只,雌雄各半,体质量 2.0~2.5kg。随机分 为实验组和对照组,每组 10 只,右眼为实验眼。购自广东省医学实验动物中心,合格证 号:SCXK(P<0.05)粤)2003-0002,粤监证字 2006mm×6mmA001。 1.3 实验方法 50mg/2mL 盐酸氯丙嗪+100mg/2mL 氯氨酮肌肉注射麻醉兔,切除右 眼第三眼睑,并用 2 张 16mm×6mmmm×6mm×6mmmm 的滤纸条蘸 1mol/L 的 NaOH 溶液置于距兔角膜缘上 方 2mm 的结膜上,90s 后立即用 100mL 生理盐水反复冲洗结膜囊。术后对照组局部应用 生理盐水滴眼,每日 3 次;实验眼局部应用安贺拉滴眼液,每日 3 次。用药 4 周后行结膜印迹 细胞学检查,并取病变区结膜行组织病理学检查和免疫组化染色检测特异性黏蛋白 MUC5AC 的表达。 1.3.1 印迹细胞学检查及 PAS 染色将孔径为 0.2μmm 的醋酸纤维膜剪成 3mm×3mm 大小,浸入蒸馏水 3~4h,以消除滤纸表面活性,取出晾干高压消毒备用。检查前结膜囊先滴 1%爱尔卡因 1 滴,5min 后,滤纸吸去穹隆部泪液,将醋酸纤维膜的粗糙面贴于距上方角膜缘 2mm 的球结膜表面,轻轻加压,3~5s 之后撕下,然后于其左右相邻的区域再各贴一 张,φ=95%乙醇固定 10~30min,然后依次用 0.5%高碘酸氧化,过碘酸希夫染色剂 (P<0.05)periodicacidSchiffstaining,PAS)染色,偏重亚硫酸漂洗,苏木素复染,二甲苯透明,中性树 脂封片,置于双目光学显微镜下观察上皮细胞的连接,胞核胞浆的颜色,核浆比例(P<0.05)N/C),上皮 细胞角化以及杯状细胞密度。 1.3.2 组织病理学检查用药 4 周取病变部位球结膜,生理盐水冲洗干净后放入 10%甲醛 固定液固定。流水冲洗固定组织过夜。依次进行乙醇梯度脱水,φ=70%乙醇 15s,80%、90%、95%、100%乙醇各 3h。二甲苯透明 3 次,每次 10min。从低熔点石 蜡到高熔点石蜡浸蜡共 3 次,每次 1h。将浸蜡后的组织放入包埋盒内,倒入熔化的高效切片 石蜡,待凝固后取出石蜡块。将石蜡块安装在切片机的组织固定架上用,调节切片厚度在 4~6mm×6mmμmm 每个石蜡块切 2~3 张切片。 1.3.3 免疫组织化学染色将组织片放入 20℃温水中展开,贴于玻片上,放入烘箱内烘干 5min,依次放入二甲苯脱蜡和 95%乙醇各 2 次,每次 1min。PBS(P<0.05)0.01mol/L,PH7.4)漂洗 3min×3;4℃1%Tris5CSITriton100 通透 5min,用 PBS 漂洗 3min×3;加 20μmL 即用型过氧 化物酶阻断剂于室温下孵育 10min,用 PBS 漂洗 3min×3,以消除内源性过氧化物酶的活性; 加 20μmL 非免疫动物血清于室温孵育 5min,以减少非特异性背景染色;倾去血清吸去多余液 体,滴加一抗(P<0.05)MUC5AC)于 4℃孵育 12h,用 PBS 漂洗 3min×3;加 20μmL 生物素标记的二抗, 于室温下孵育 10min,用 PBS 漂洗 3min×3;加 20μmL 辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素于 室温下孵育 10min,用 PBS 漂洗 3min×3;加新鲜配制的 DAB 显色液显色,显微镜下观察结 果,1~2min 水洗终止反应;苏木素复染核 15~30min,染色过深者用盐酸酒精漂洗;每一批 实验均设有阳性及空白对照,阳性对照:采用已知阳性的胃癌切片(P<0.05)由试剂公司提供);空白对 照:以 PBS 代替一抗。 1.4 结果判定 1.4.1 印迹结膜杯状细胞观测分级根据 NELSON’s 分级标准进行分级[3]:0 级:结膜上 皮细胞形态正常,层次大小一致,胞浆蓝绿色,N/C 为 1∶2,杯状细胞密集分布;1 级:结膜上皮细