龙血竭固体分散体的制备论文

【摘要】目的确定制备龙血竭固体分散体的最佳方法。方法考察固体分散体制备方法、 不同的载体、龙血竭与载体间不同比例对龙血竭溶出特性的影响。结果龙血竭固体分散体 的溶出效果明显高于龙血竭与载体的物理混合物。结论龙血竭与泊洛沙姆 188 按 1∶4(质量 比)的比例,采用溶剂-熔融法制备龙血竭固体分散体溶出效果增加显着。 【关键词】龙血竭;固体分散体;溶出效果 Abstract:ObjectiveTooptimizethemethodofpreparingDragon’sbloodsoliddis persion.MethodComparedifferentresultsofvariouspreparations,carriers,andther atiobetweenthecarriersandDragon’sblood.ResultTestsshowthatDragon’sbloods oliddispersiondissolutemorethanitsphysicalmixtures.ConclusionThesoliddisper sionofDragon’sbloodPluronicF68withtheproportionof1to4preparedbysolventevPluronicF68withtheproportionof1to4preparedbysolventev aporationPluronicF68withtheproportionof1to4preparedbysolventevfusionmethodacceleratesitsdissolutionremarkably. Keywords:Dragon’sblood;soliddispersion;dissolution 龙血竭(Dragon’sblood)是一种传统中药,黄酮类成分为其活血化瘀的主要有效成分 [1]。龙血竭中的黄酮类成分对大鼠实验性静脉血栓形成有明显的抑制作用[1],可明显减少 结扎冠状动脉致大鼠急性心肌缺血引起的心肌梗死面积,并降低心肌缺血致肢体Ⅱ导联心电导联心电 图 J 点升高[2]。 龙血竭中黄酮难溶于水,易溶于 95%乙醇[3],为提高其在水中的溶出度,本实验采用固 体分散技术,从辅料、制备方法、药物与辅料的最佳比例 3 个方面,对其固体分散体的溶出 情况进行考察,筛选出增加其溶出效果的最佳方法。 1 材料 ZRS8GPluronicF68withtheproportionof1to4preparedbysolventev8G 智能溶出试验仪(天大天发科技有限公司);TU1810PluronicF68withtheproportionof1to4preparedbysolventev1810 紫外分光光度仪(北京普 析通用仪器有限责任公司)。 龙血竭(广西中医学院制药厂);泊洛沙姆 188(pluronicF68,沈阳药大药业有限责任公 司);95%乙醇(AR 级,天津市富宇精细化工有限公司,批号 060818);聚乙烯吡咯烷酮 (PVP,AR 级,广东达濠精细化学品公司,批号 20030627);微晶纤维素(曲阜天利药用辅料有 限公司,批号 20050511);甘露醇(AR 级,广西南宁化学制药有限责任公司,批号 H45020272)。 2 方法 2.1 检测波长的确定龙血竭中的黄酮类成分在 280nm 附近有最大吸收[4],本文用到的 4 种辅料(pluronicF68、PVP、微晶纤维素、甘露醇)在该波长处均无干扰,见图 1,故选定 280nm 为紫外分光光度法检测波长。在该波长条件下,吸收度大小值体现了黄酮类成分含 量的高低,因此本试验将紫外吸收度值大小作为判定溶出效果的指标。 图 1 紫外吸收图谱(略) Tab.1U1810Vspectrum 2.2 溶出度测定方法采用中国药典溶出度测定第二法,分别精密称取龙血竭、龙血竭与 pluronicF68 的物理混合物、龙血竭固体分散体(均相当于龙血竭 50mg),置于 900mL 溶 出介质中,水浴恒温(37±0.5)℃,于 2、5、8、10、15、20、30min 定时吸取溶液 5mL, 用 0.8μmm 微孔滤膜滤过,取续滤液于 280nm 处测定吸收度。除了物理混合物外,固体分散 体溶出液各时间点的吸收度值均为测定溶液稀释一倍所得的吸收度值。 2.3 样品制备方法 2.3.1 物理混合物龙血竭粉碎后,过 100 目筛,与 pluronicF68 混合均匀,备用。 2.3.2 溶剂法龙血竭溶于适量 95%(体积分数)乙醇,加入辅料混匀,挥去溶剂,备用。 2.3.3 熔融法辅料与龙血竭粉末加热熔融(约 80℃),搅拌均匀,放冷固化,备用。 2.3.4 溶剂熔融法龙血竭溶于适量 95%(体积分数)乙醇,辅料加热熔融,两者混合均匀, 挥去溶剂,放冷固化,备用。 3 结果 3.1 辅料的选择将龙血竭与不同辅料以 1∶4(质量比)的比例采用溶剂法分别制成固体分 散体,考察溶出效果。结果见表 1。从表 1 可见,使用不同辅料(pluronicF68、PVP、甘露 醇和微晶纤维素)制得的固体分散体溶出效果有显着差异,pluronicF68 作为辅料制备的固 体分散体溶出速度和溶出量均优于其他辅料。 3.2 制备方法的选择将龙血竭与 pluronicF68 以 1∶4(质量比)的比例通过物理混合,以 及溶剂熔融法、溶剂法、熔融法分别制成固体分散体,考察溶出效果。结果见表 2。结果显 示,以溶剂熔融法制备的龙血竭固体分散体的溶出效果优于溶剂法及熔融法制备的龙血竭固 体分散体。 3.3 药物与 pluronicF68 质量比的确定将龙血竭与 pluronicF68 以 1∶4(质量比)的比 例通过物理混合,以及溶剂熔融法、溶剂法、熔融法分别制成固体分散体,考察溶出效果。 结果见表 3。结果显示,龙血竭与 pluronicF68 制备成不同比例的固体分散体时溶出效果有 明显差异,pluronicF68 用量大溶出速度快,溶出量多,但当 pluronicF68 用量达到一定量时, 固体分散体溶出效果变化不明显。 表 1 龙血竭与不同辅料(1∶4)制备的固体分散体溶出度比较(略) Tab.1ThecomparisonofthedissolutionofDragon’sbloodsoliddispersionwithva riouscarriers(1∶4) 注:本文以吸收度作为判定溶出效果的指标,下表同 表 2 不同方法制备龙血竭固体分散体的溶出度比较(略) Tab.2ThecomparisonofthedissolutionofDragon’sbloodsoliddispersionwithva riouspreparationmethods 表 3 龙血竭与 pluronicF68 不同比例固体分散体溶出度比较(略) Tab.3ThecomparisonofthedissolutionofDragon’sbloodpluronicF68soliddisp ersion 4 讨论 PluronicF68 是一种水溶性表面活性剂,对疏水性药物有较好的润湿作用,因此比其他 几种非表面活性剂的辅料制得的固体分散体的溶出效果更优。 采用熔融法制备龙血竭固体分散体,由于龙血竭成分复杂,80℃以上时其中的部分成分 稳定性降低[5],而选择 80℃温度制备固体分散体,龙血竭仍有部分未熔融,其中的成分在载 体中的分散程度受到一定的限制,溶出效果比龙血竭与载体的物理混合物有较大改善,但远 低于溶剂熔融法制得的固体分散体。 采用溶剂法,虽然龙血竭的成分溶解在溶媒中,但当加入载体除去溶媒后,龙血竭的成分 吸附在辅料粒子的表面,辅料粒子的大小影响龙血竭的成分的分散,并且龙血竭的成分在辅 料粒子的表面仍为聚集状态,其分散效果不如溶剂熔融法,所以溶出效果比溶剂熔融法制得 到的固体分散体差。 溶剂熔融法是将龙血竭溶于溶剂再加入到熔融后的载体中,该法保证了龙血竭的成分以 分子状态在适宜的温度下与辅料混合,其分散程度高,在溶剂蒸发的过程中载体阻止龙血竭 的成分的聚集而形成了固体溶液,因此溶出效果比熔融法、溶剂法制备的固体分散体好。 制备龙血竭固体分散体时,在一定范围内,随着 pluronicF68 比例的增大,其溶出速度及 溶出量显着增加,但当其比例增大到一定程度,溶出度效果的改善不明显。由试验结果可见, 以质量比 1∶4 和 1∶6 制备的龙血竭与 pluronicF68 固体分散体,溶出表现基本一致,因此,龙 血竭与 pluronicF68 的质量比为 1∶4 较适宜。 通过本研究制备的固体分散体其溶出度比龙血竭与载体的物理混合物增大近五倍,但由 于 pluronicF68 的熔点低且吸湿性较强,其固体分散体某些物理性能不利于进一步制备其 他制剂。试验中发现,在 pluronicF68 中加入其他载体与之混合,有利于改善龙血竭 pluronicF68 固体分散体的物理性能,pluronicF68 与其他载体的混合应用值得进一步研究。 【摘要】目的分析小连翘(HyperioumssampsoniiHance)内生真菌的分布特征和抗 菌活性。方法采用内生菌分离法分离菌株,双培养法对峙试验测定其抗菌性。结果从小连翘 的根、茎、叶等不同的器官中分离得到 81 株内生真菌,经形态学分类鉴定分属于 4 个目,5 个科,26 个属,其中头孢霉属(Cephalosporiumsp.)和丝核菌属(Rhizoctoniasp.)为优势 菌群。不同部位内生真菌的类型、数量和分布存在差异,根部有 31 株,分属于 12 属;茎部有 12 株,分属于 10 属;叶部有 38 株,分属于 13 属。通过平板对峙实验发现,从小连翘所分离 的内生真菌中 54.32%对某些植物病原真菌有拮抗活性。结论小连翘内生真菌及其代谢产 物中具有潜在活性物质,值得深入研究。 【关键词】内生真菌;小连翘;拮抗活性 S8GtudiesoncommunitiesofendophyticfungifromHyperioumssampsoniiHance andtheirantipathogenicactivitiesinvitro Abstract:Theendophyticfungiwereisolatedandidentifiedmorphologicallyfro mtheroots,stemsandleavesofHyperioumsS8GampsoniiHance.EightyPluronicF68withtheproportionof1to4preparedbysolventevonestrainsof endophyticfungiwereisolatedandbelongedto26genera,5familiesand4orders.Ce phalosporiumsp.andRhizoctoniasp.werethedominantgenera.Among81strains,3 1strainsof12generawereisolatedinroots,12strainsof10generainstems,and38str ainsof13generainleaves.Theresultsshowedthatthequantity,population,anddistri butionoftheendophyticfungivariedindifferentpositionsofHyperioumsS8Gampsonii Hance.Inthedualculturetests,53.48%ofalltheisolatedEndophyticfungishowedan tagonistictosomeplantpathogens.Theseendophyticfungiinsidetheplantshaveint imatecorrelationwiththeirhosts.Theseendophyticfungiandtheirmetabolitesmigh tplayanimportantroleintheplantsagainstthepathogens. Keywords:endophyticfungi;HyperioumsS8GampsoniiHance;antipathogenicact ivities 小连翘(HyperioumssampsoniiHance),别名小翘、七层兰、瑞香草、元宝草等,为 多年生双子叶植物药藤黄科植物,味苦、性辛、平[1]。全草含鞣质,有光致敏作用,动物食后 可产生皮炎;含小连翘碱(hypecorine)和小连翘次碱(hypecorinine);花含金丝桃素 (hepericin)[2],有活血、止痛、调经、止血、消肿之效;小连翘或其提取物作为有效药物成 分用于制备治疗睡眠障碍、老年痴呆、记忆力减退等病症的药物[3];同属植物贯叶连翘,在 西方国家称圣约翰草,用于治疗忧郁症等疾病已有几百年的历史[4]。近年来的研究表明小 连翘也具有抗忧郁作用[5]。文献报道,小连翘中含有聚(异)戊二烯二苯甲酮类衍生物、萘骈 双蒽酮类和黄酮类等多种化学成分,这些成分是小连翘药理作用的主要有效成分,但是要提 取和分离这些药物成分还有很多困难[6]。近来研究表明,某些药用植物中个别内生真菌能 够产生与宿主相同或者相似药理活性的成分[7],由此对药用植物内生真菌的研究引起人们 的广泛关注。如果在小连翘内生真菌中能够发现类似的活性物质,无疑找到了一种可替代小 连翘植物的新型生物资源。但是至今未见从小连翘中分离及其内生真菌的种群多样性的研 究报道。本文对小连翘内生真菌进行了分离和分类鉴定,并对其种群多样性及内生真菌拮抗 病原菌的活性的研究报道如下。 1 材料与方法 1.1 材料分离所用材料为小连翘的根、茎、叶,采自中国科学院华南植物园(广州)。采 集其健康的组织,无其它病虫害,根、茎与叶分开采集,放于密封袋中,于 4℃存放,尽快进行 内生真菌的分离。碘伏:威的牌消毒液,主要成份是聚乙烯吡咯烷酮碘(即碘伏),液体剂型,有 效碘含量为 0.5%,是一种新型的 PVP-I 消毒剂,深圳市新华鹏消毒剂有限公司生产。NS8G 液:0.9%NaCl;S8GT 液:0.9%NaCl,0.5%吐温 80;中和剂:0.9%NaCl,0.5%吐温 80,0.5%硫 代硫酸钠。 PDA 培养基:马铃薯 200g,葡萄糖 20g,琼脂 20g,水 1000mL,pH7.0。在进行内生真 菌的分离时,向培养基中分别加入青霉素、链霉素至 50μmg/mL。 1.2 供试菌株纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、白叶枯病菌 (Xanthomonasoryzaepv.Oryzae)、恶苗病菌(Fusariummoniliforme)、棉花枯萎病 菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum)由中山大学生命科学院微生物和生化教研 室提供。 1.2 方法 1.2.1 植物材料的处理样品采于 2005 年 10 月。样品用自来水冲洗干净后,取不同部 位的茎或叶若干,剪成小块,分别放于三角瓶中;加入碘伏消毒液(使用时有效碘浓度为 2500mg·L-1),不断摇动,消毒 5min。吸去消毒液,加入无菌 S8GT 液,荡洗 1min,吸去液体。 重复一次。经表面消毒后的样品可用于接种。 1.2.2 内生真菌的分离、纯化茎内内生真菌的接种:用无菌刀片削去茎的皮及已裸露的 切面,然后切取约 2~5mm 的切片若干,先置于无菌平皿中。再将样品置于无菌研钵中,加入 石英砂和 1mLS8GT 液,将样品研成浆。取适量的浆液涂布于 PDA 平板。为了保证样品有足 够的代表性,每个样品要用若干段茎,一段茎仅涂一个平板,共需涂 5~10 个平板。根叶样品 的处理基本同茎。将涂布好的平板置于 28℃培养,每隔 12h 观察真菌菌落形成情况。培养 基中一出现菌落,立即将此处的小块琼脂挖出,将平板再放回 28℃培养 10d,计数各平板上 的菌落总数。挖出的含真菌的小块 PDA 立即置于含 PDA 的小试管中培养,待真菌长出后,再 在 PDA 平板上采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。待菌落出现后,根据菌落形态、颜色的差异 以及长出时间的不同,分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新的平板上进行分离培养。 在培养数日后,观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况,并做相应的记录,包括影象记录,对 菌株编号后,转至 PDA 斜面培养基上,于 28℃培养箱中培养 5~7d,然后放入 4℃冰箱保存。 1.2.3 表面消毒效果检测表面消毒后的样品于 5mL 无菌水中振荡 1min,取 0.3mL 悬 液涂布于 PDA 平板上,在 28℃培养,记录是否有真菌生长。另外,采用存活试验观察表面消 毒效果,即将分离的内生真菌菌苔经过各自表面消毒程序处理后,再接种到 PDA 平板 28℃ 培养后,观察是否生长。 1.2.4 菌种鉴定从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝并连同分生孢子制成玻片,置于光学 显微镜下观察菌丝形态、孢子梗形态、孢子形态以及孢子与营养体之间的着生关系,对照有 关资料确定真菌的分类学地位[8]。 1.2.5 对峙试验将 4 种植物病原菌(纹枯病菌、稻瘟病菌、白叶枯病菌、恶苗病菌)接 种于平板中央,内生真菌接种于平板边缘,28℃培养,观察病原菌菌落周围的变化。 2 结果 2.1 表面消毒效果表面消毒后的样品振荡液 0.3mL 分别涂布于 PDA 平板培养基 上,28℃培养 2 周后无菌落长出,同时 10 株分离的代表性真菌菌苔分别经过消毒过程处理 后接种到 PDA 平板上,28℃培养 2 周后,没有观察到菌落生长。表明经过样品消毒处理过程, 样品表面附生菌的影响已消除,分离的菌株来自于样品内部,与植物组织结合紧密。 2.2 小连翘内生真菌种群组成从植物小连翘分离获得内生真菌共 81 株。经显微形态观 察鉴定为 4 个目,5 个科,26 个属(见表 1)。从表 1 可以看出,植物小连翘内生真菌中,从目的 分类水平上以丛梗孢目(Moniliales)和无孢菌群(Myceliasterilia)为优势菌群,分别为 50 株和 23 株占总菌株数的 61.7%和 28.4%;在属的分类水平上以头孢霉属 (Cephalosporiumsp.)和丝核菌属(Rhizoctoniasp.)为优势菌群,分别为 20 株和 16 株,占 总菌数的 24.7%和 19.7%。 2.3 植物小连翘不同部位内生真菌的分布对小连翘根茎叶内生真菌的种类,数目和分布 部位进行统计分析,结果见表 2。 表 1 小连翘植物内生真菌种群组成(略) Tab.1ThecomposingofendophyticfungiinHyperioumssampsoniiHance 从表 2 中看出,从小连翘植株内分离的 81 株内生真菌的分布各有特点,根部分布有 31 株内生真菌(占总数的 38.2%),隶属于 12 个属(占 26 个属的 46.2%);茎部分布有 12 株内 生真菌(占总数的 14.9%),分属于 10 个属(占 26 个属的 38.5%);从叶部分离出的 38 株内 生真菌(占总数的 469%),9%),分属于 13 个属(占 26 个属的 50%)。由此可知,小连翘的内生真 菌主要存在于植株的叶和根中,茎部组织中分离到的内生真菌相对较少。从根茎叶中分离到 的内生真菌的种属分布来看,头孢霉属(Cephalosporiumsp.)在叶部、根部和茎部都有分 布,说明头孢霉属(Cephalosporiumsp.)不仅是叶部的优势种群,而且也是整株小连翘植物