血竭凝血和抗血小板聚集论文

【摘要】目的考察不同产地血竭在凝血和抗血小板聚集方面的作用。方法采用毛细血 管法测定凝血时间,体内血小板致聚剂——胶原和肾上腺素诱导小鼠血瘀模型。结果不同产 地血竭对正常小鼠的凝血功能均有一定的抑制作用,可较明显抑制小鼠对血小板致聚剂诱发 的血小板聚集作用。结论国产血竭和进口血竭均有一定的活血化瘀和抗血栓形成的作用。 【关键词】血竭;凝血时间;血小板致聚剂 Abstract:ObjectiveToassesstheactivityinbloodclottingandantiplateletaggre gationofdragonbloodfromdifferenthabitats.MethodsCapillarymethodwasusedto getclottingtimeandcongestivemicemodelinducedwithcollagenproteinandepine phrinehydrochloridewasused.ResultsDragonbloodfromdifferenthabitatshaveso meinhibitoryactionsonbloodclottingofhealthyKunmingmice,plateletaggregation inducedbyplateletactivationwasalsoinhibitedobviously.ConclusionDragonblood sfromChinaandabroadhavesomeeffectsonpromotingbloodcirculation,removing bloodstasisandanti-thrombosis. Keywords:Dragonblood;clottingtime(CT);plateletaggregation 血竭(dragonblood)是珍贵的中药传统品种之一,主要来源于棕榈科麒麟竭及百合龙血 树属龙血竭,进口的血竭主要为棕榈科麒麟血竭。国产龙血竭与进口棕榈科的血竭相比,在 化学成分上有较大差异,国产血竭对血液系统、心血管系统有较强的药理作用[1-3]。本研 究的目的是以凝血时间和抗血小板聚集反应为指标,比较不同产地血竭凝血和抗血小板聚集 作用,为进一步研究国产血竭替代进口血竭在血液方面的作用机制提供理论依据。 1 实验材料 1.1 药品与试剂广西、云南、印尼、龙王、柬龙 5 种产地血竭原料,购于市场,由广东药 学院药科学院天然药物化学教研室吕华冲副教授鉴定,自处理:用 95%乙醇索式提取,所得醇 溶物干燥,按血竭醇溶物∶泊洛沙姆∶聚乙二醇 4000(质量比为 1∶2∶1),乙醇溶剂熔融法制备成 固体分散体;地奥心血康,成都地奥制药集团有限公司,批号 060611;复方丹参片,广州白云 山和记黄埔中药有限公司(原广州白云山中药厂),批号 20051025;盐酸肾上腺素注射液,北 京市永康药业有限公司 1mL∶1mg,批号 05100241;I 型胶原蛋 白,NorthingtonBiochemicalCorporation 公司,1g 分装,批号 35E8048。 1.2 动物昆明小鼠,SPF 级,雄性,体质量 18~22g,购于广东省实验动物中心,合格证号 2006A017。 1.3 仪器上皿电子天平 FA2104(上海精密科学仪器有限公司);钻石牌机械秒表(上海星 钻秒表有限公司);电动玻璃匀浆机 DY89-1 型(宁波新之生物科技股份有限公司)。 1.4 药品、试剂的前处理与配制血竭溶液:分别称取广西、云南、印尼、龙王、柬龙血 竭固体分散体各 10g,再分别称取广西、印尼血竭固体分散体各 5g 和 2.5g,共 9 份,分别加 100mL 注射用 0.9%NaCl 研磨均匀,即得 9 种不同类型和剂量的血竭溶液。 复方丹参片溶液:复方丹参片 3 片加 20mL 注射用 0.9%NaCl 研磨均匀,即得 15mg/ mL 丹参混悬液;地奥心血康溶液:地奥心血康胶囊 10 粒加 100mL 注射用 0.9%NaCl 研磨 均匀,即得甾体总皂甙 10mg/mL 地奥混悬液。 血小板聚集诱导剂溶液:精密称取Ⅰ型胶原型胶原 01mg,1mg,加入 75mL 的生理盐水,用电动匀 浆机冰浴下匀浆 4h,再静置冷藏 2d,临用前 1d,加入 20mL 盐酸肾上腺素注射液,摇匀,定容 到 100mL,冰箱 4℃冷藏,避光保存备用。 2 方法 2.1 毛细管法测定血液凝聚时间(自改良)昆明小鼠 192 只,♂,按体质量分类、随机分组, 每组 16 只,分为 NS 组、阳性对照组(复方丹参片组 0.3g/kg、地奥心血康胶囊组 0.2g/ kg)、不同产地龙血竭固体分散体组(广西血竭组分为 0.5g/kg、11mg,0g/kg、2.0g/kg 低中 高三组,印尼血竭组分为 01mg,5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg 低中高三组,云南组 21mg,0g/kg,龙王 血竭组 2.0g/kg,柬龙血竭组 2.0g/kg);实验设计空白对照组给予 0.9%氯化钠溶液,每天按 体质量灌胃给药 1 次,连续给药 7d。 末次给药 1.5h 后,在 17℃的空调房间内,用毛细管插入小鼠眼底静脉丛取血,深约 4~5mm,轻轻转动,自血液流入管内按动秒表、开始计时,血液注满后取出毛细管平放于水 平台面,每隔 10s 向两侧倾斜一次,观察血液流动性,记录出现血液不再流动的时间[4]。 2.2 药物对胶原蛋白和肾上腺素诱导血瘀模型小鼠的保护作用[5]昆明小鼠 240 只,♂, 按体质量分类,随机分组,每组 20 只,分组同 2.1,每天按体质量给药,连续给药 7d。 末次给药 1.5h 后,小鼠尾静脉注射胶原蛋白和肾上腺素的混合诱导剂,诱发动物血栓性 偏瘫甚至死亡,记录注射后 10min 内小鼠死亡数,计算恢复率以及存活时间。小鼠 10min 内存活计为恢复,恢复率=每组恢复动物数/每组动物数×100%[6,7],存活时间≥10min 的, 统一记录存活时间为 10min。 2.3 统计学处理凝血时间数据以(±s)s)表示,用单因素方差分析(SAS 统计软 件,version9.0),以 P<0.05 为差异有显着性;每组动物恢复数进行 χ2 检验,组间差异采用 两两组间 χ2 检验(SAS 统计软件,version9.0),以 P<0.05 为差异有显着性;存活时间先进 行 F 检验,检验方差齐性,再进行 t 检验。 3 结果 3.1 不同产地血竭制剂对小鼠凝血时间的影响经单因素方差分析,各给药组与空白组比 较差异均有显着性(P<0.01);给药组间进行比较,地奥心血康组、广西高剂量组、印尼中剂 量组和高剂量组可较明显延长小鼠的凝血时间,印尼中剂量和高剂量组作用最强,此两组差 异无显着性(P>0.05),其余给药组差异无显着性(P>0.05)。由实验结果可知,广西和印尼血 竭的延长凝血时间作用似有浓度相关性,印尼 1g/kg 组为有效浓度。复方丹参片,作为临床 的常用活血化瘀药,延长凝血时间方面的作用并不很强。地奥心血康可较明显延长小鼠凝血 时间,但与印尼组相比差异无显着性。见表 1。 表 1 不同产地血竭对正常昆明小鼠凝血时间的影响(略) Tab.1EffectofDragonbloodfromdifferenthabitatsontheclottingtimeofKMmic ewithcapillarytest 与空白对照组比较:*P<0.01P<0.01 3.2 不同产地血竭对血栓形成小鼠存活时间的影响每组恢复动物数进行 χ2 检 验,χ2=24.6257,P<0.05,不同给药组对血栓形成小鼠存活率差异有显着性。两两组间 χ2 检验,P>0.05,提示广西与印尼血竭的效果似无浓度相关性,各浓度组组间差异无显着性;广 西和印尼的高剂量组、云南组、龙王组、柬龙组 4 组组间对小鼠存活率的改善作用差异无 显着性,相比较而言,广西和印尼的低剂量组、云南组同丹参组、地奥组有较好的提高小鼠 存活率的作用,龙王和柬龙组对小鼠存活率的改善作用比丹参组、地奥组差,差异有显着性。 存活时间先进行 F 检验,组间方差齐性,给药组与空白组经 t 检验,给药组能明显提高小 鼠的存活时间;给药各组对提高小鼠存活时间的作用差异无显着性(P>0.05)。结果见表 2。 表 2 不同产地血竭对血栓形成昆明小鼠存活时间的影响(略) Tab.2EffectsofDragonbloodfromdifferenthabitatsonthelivingtimeofcongesti vemiceinducedwithcollagenproteinandepinephrinehydrochloride 与空白对照组比较:*P<0.01P<0.01 4 讨论 毛细管测定凝血时间法是一种经典的血液、心血管作用药物有效性的初筛方法,具有操 作简单、无设备性要求的优点[4]。本研究在此经典方法上稍作改进,以观察毛细管中血液 流动性为凝血的观测指标,当发生流动性减慢时,毛细管中的某一区段可能先有凝血小栓形 成,采用此法比原先的经典观察法——折断毛细血管观察血凝丝,可更有效地减少实验中的 人为操作误差和环境误差,避免毛细管中某一小段区域先发生了凝血而在折断毛细管的过程 中未观察到,提高了实验数据的可靠性和均一性。 胶原和肾上腺素致血瘀模型是中医学上常用的致血小板聚集血栓栓塞模型,胶原可以激 活血小板膜上磷脂酶 A2,加速磷脂水解释放花生四烯酸,花生四烯酸在环氧酶以及进一步血 栓烷 A2 合成酶的作用下转化为血栓素 A2(TXA2),促进血小板聚集,肾上腺素兼有 α 受体和 β 受体的激动作用,其激动 α 受体可引起皮肤、黏膜、内脏血管收缩,其激动 β 受体可引起 骨骼肌和心肌兴奋、心率加快等作用,故胶原和肾上腺素合用具有增强致血小板聚集的协同 作用。 我国的血竭长期以来主要靠进口,国产血竭为血竭资源的开发利用开辟了前景。本实验 研究表明:不同产地血竭可明显延长正常小鼠凝血时间,血液状态明显比正常组颜色更鲜红。 国产血竭有与进口血竭近似的活血作用。对正常小鼠凝血时间的改变作用,不同产地血竭有 差异,广西血竭与印尼血竭延长凝血时间(CT)的作用相对最强,这与胡海燕等人的报道不同 [8]。对胶原与肾上腺素合用致血栓栓塞小鼠的保护作用,不同产地血竭没有差异,广西和云 南血竭在保护血小板致聚剂诱导血栓形成小鼠的方面的作用相对比较强。且广西和印尼血 竭作用效果似没有浓度相关性。广西和云南血竭作为国内主要的血竭资源,是否可以完全代 替印尼血竭以及深入探讨血竭的活血作用机制,还需要进一步的实验研究。 【摘要】简化头孢唑肟钠的合成路线。方法以 7氨基3去甲基3头孢烷酸为原料,与 2(2氨基4噻唑基)2甲氧亚胺乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸,再与异辛酸钠反 应制得头孢唑肟钠。结果与结论所制得的产品质量好,产率达 871mg,4%。本方法操作简便,适 于工业化生产。 【关键词】头孢唑肟钠;合成;7氨基3去甲基3头孢烷酸 Abstract:Ceftizoximewaspreparedthroughthereactionof7amino3cephem 4carboxylicacidwith2(2aminothiazol4yl)2(Z)methoxyiminoaceticacidSbe)methoxyiminoaceticacidSbe nzthiazolylthioester,followedbythereactionwithsodium2ethylhexanoate.Theyi eldwas87.4%.Thesynthesisissimpleandsuitableforindustrialproductionofceftizo ximesodium.. Keywords:ceftizoximesodium;synthesis;7amino3nor3cephem4carbox ylicacid 头孢唑肟钠(ceftizoximesodium)是由日本腾泽药品工业公司开发,并于 1982 年首先 在日本上市,商品名为 ceftizox。本品属第三代头孢菌素抗生素,具有广谱、高效、耐酶、 低毒和能通过血脑屏障的特点[1~2],临床上广泛用于治疗各种中、重度感染。 有关头孢唑肟钠的合成,文献[3]报道了 2 条合成路线。第 1 条是以 7苯乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸氨基3头 孢菌素4羧酸对甲氧苄酯为原料,在 C7 位侧链引入 2顺甲氧亚氨基甲氧亚氨基2(2甲酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸氨基)噻唑 乙酸,之后脱去 C4 位引入侧链的保护基团,得到头孢唑肟酸,再与成盐剂制得头孢唑肟钠,此 路线多次脱去保护基团,延长了反应步骤,增加了操作程序及生产成本。第 2 条是以 7氨基 3去甲基3头孢烷酸(7ANCA)为原料与氨噻肟乙酸直接缩合得头孢唑肟酸再成盐,此路 线副反应较多,所得产物需经柱层析纯化。 结合国内实际情况,本文对第 2 条路线进行改进,以 7ANCA 为原料,与 2(2氨基4噻 唑基)2甲氧亚胺乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸苯并噻唑硫酯(AE活性酯)缩合制得头孢唑肟酸,再与成盐剂反应得 头孢唑肟钠。合成路线见图 1。 1 实验部分 1.1 主要试剂和仪器 7氨基3去甲基3头孢烷酸(7ANCA,浙江台州新星制药 厂),2(2氨基4噻唑基)2甲氧亚胺乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸苯并噻唑硫酯(AE 活性酯,山东沂源制药 厂,HPLC 法纯度 99.7%),其他试剂为工业品。 Brucker400 核磁共振仪,Agilent1100 高效液相色谱仪。 1.2 头孢唑肟酸的合成[4~5]取 7ANCA10g(0.050mol)加入二氯甲烷 160mL 中,搅 拌成混悬液,室温下滴加三乙胺乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸 14mL(01mg,100mol),滴毕,搅拌 10min,将 AE 活性酯 191mg,36g(0.050mol)加至上述溶液中,在 25~30℃反应 5h。反应毕,用 200mL×2 水提取, 合并水相,滤过,将水溶液调 pH 至 5.5,加入活性炭 0.2g,室温脱色 30min,滤过,水洗滤饼, 合并滤液,用 2mol/L 盐酸将滤液 pH 调至 2.0,析出淡黄色固体,滤过,用二氯甲烷 (30mL×3)洗滤饼,真空干燥,得头孢唑肟酸 17.3g,收率 90.3%,HPLC 归一化法纯度 99% 以上。 图 1 头孢唑肟钠的合成路线(略) Fig.1Synthesisofceftizoximesodium 1HNMR(DMSOd6)δ:3.34~3.66(2H,m),3.84(3H,s),5.09(1H,d,J=4.8Hz),5.81 (1H,dd,J=4.8Hz,8.4Hz),6.47~6.49(1H,m),6.73(1H,s),7.23(2H,s),9.61(1H,d,J=8. 4Hz),数据与文献[3]一致。 1.3 头孢唑肟钠的合成取 10g(0.026mol)头孢唑肟酸溶于 20mL 去离子水中,搅拌成 混悬液,在 5℃下滴加三乙胺乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸 4.1mL(0.029mol),搅拌溶解,加入活性炭 0.2g,脱色 30min, 滤过,少量水洗滤饼,合并有机层,5℃下滴加异辛酸钠 6g(0.036mol)与乙醇 10mL 形成的 溶液,加毕,搅拌 40min,缓慢滴加乙醇 100mL,析出类白色固体,搅拌 2h,滤过,30℃真空干 燥 4h,得类白色粉末 9.2g,收率 87.4%(文献[3]收率 841mg,2%),HPLC 归一化法纯度 99%以 上。1HNMR(DMSOd6)δ:3.35(2H,m),3.47(3H,s),4.95(1H,d,J=3.9Hz),5.62(1H,d d,J=3.8Hz,6.6Hz),5.96(1H,m),6.71(1H,s),7.23(2H,s),9.51(1H,d,J=6.6Hz)。 2 结果与讨论 2.1C7 位缩合方法的选择文献[6]报道的 C7 位缩合方法有酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸氯法、活性酯法及二环己 基碳二亚胺乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸(DCC)直接脱水等方法。酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸氯法要求无水操作,且需要在低温下进行;采用 DCC 做缩合剂时,侧链氨基需保护。综合以上方法,本文采用活性酯法,工艺简单,反应条件温和, 所得产物杂质少,产率高。 2.2 成盐剂的选择据文献[6]报道,合成头孢唑肟钠所选用的盐有碳酸氢钠和氢氧化钠, 后者碱性太强易使 β内酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸胺乙酰苯并噻唑硫酯反应制得头孢唑肟酸环断裂开环,前者在成盐后过量的碳酸氢钠难除去,本文采用异 辛酸钠/乙醇溶液作为成盐剂,有利于工业化生产,所得产品纯度高,过量的异辛酸钠易除去。 【摘要】目的确定制备龙血竭固体分散体的最佳方法。方法考察固体分散体制备方法、 不同的载体、龙血竭与载体间不同比例对龙血竭溶出特性的影响。结果龙血竭固体分散体 的溶出效果明显高于龙血竭与载体的物理混合物。结论龙血竭与泊洛沙姆 188 按 1∶4(质量 比)的比例,采用溶剂-熔融法制备龙血竭固体分散体溶出效果增加显着。 【关键词】龙血竭;固体分散体;溶出效果 Abstract:ObjectiveTooptimizethemethodofpreparingDragon’sbloodsoliddis persion.MethodComparedifferentresultsofvariouspreparations,carriers,andther atiobetweenthecarriersandDragon’sblood.ResultTestsshowthatDragon’sbloods oliddispersiondissolutemorethanitsphysicalmixtures.ConclusionThesoliddisper sionofDragon’sbloodPluronicF68withtheproportionof1to4preparedbysolventev aporationfusionmethodacceleratesitsdissolutionremarkably. Keywords:Dragon’sblood;soliddispersion;dissolution 龙血竭(Dragon’sblood)是一种传统中药,黄酮类成分为其活血化瘀的主要有效成分 [1]。龙血竭中的黄酮类成分对大鼠实验性静脉血栓形成有明显的抑制作用[1],可明显减少 结扎冠状动脉致大鼠急性心肌缺血引起的心肌梗死面积,并降低心肌缺血致肢体Ⅱ导联心电导联心电 图 J 点升高[2]。 龙血竭中黄酮难溶于水,易溶于 95%乙醇[3],为提高其在水中的溶出度,本实验采用固 体分散技术,从辅料、制备方法、药物与辅料的最佳比例 3 个方面,对其固体分散体的溶出 情况进行考察,筛选出增加其溶出效果的最佳方法。 1 材料 Z)methoxyiminoaceticacidSbeRS8G 智能溶出试验仪(天大天发科技有限公司);TU18101810 紫外分光光度仪(北京普 析通用仪器有限责任公司)。 龙血竭(广西中医学院制药厂);泊洛沙姆 188(pluronicF68,沈阳药大药业有限责任公 司);95%乙醇(AR 级,天津市富宇精细化工有限公司,批号 060818);聚乙烯吡咯烷酮 (PVP,AR 级,广东达濠精细化学品公司,批号 20030627);微晶纤维素(曲阜天利药用辅料有 限公司,批号 20050511);甘露醇(AR 级,广西南宁化学制药有限责任公司,批号 H45020272)。