岗梅水提取物抗炎实验研究论文

【摘要】目的研究岗梅水提取物的抗炎作用。方法采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法、角 叉菜胶致大鼠足跖肿胀法、大鼠棉球肉芽肿法和醋酸致小鼠毛细血管通透性增高法观察岗 梅水提取物的抗炎作用。结果岗梅水提取物能明显抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀和角叉 菜胶所致的大鼠足跖肿胀及炎性组织中 PGE2 的生成,减少大鼠棉球肉芽肿的形成,同时对 醋酸所致小鼠毛细血管通透性增高具有显着抑制作用。结论岗梅水提取物具有明显抗炎作 用。 【关键词】岗梅;水提取物;抗炎;大鼠 Abstract:ObjectiveTostudytheantiinflammatoryactivityofthewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellae.Method sThemodelsofxyleneinducedearedemainmice,hindpawedemainducedwithcarrageeninrats,granulo mainducedwithcottonballinrats,andcapillarypermeabilityincreaseinducedwitha ceticacidinmicewereusedtoobservetheantiinflammatoryeffects.ResultsThewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaeco uldinhibitxyleneinducedearedemaandcapillarypermeabilityincreaseinmice,hindpawedemaand PGE2increaseinducedwithcarrageenandgranulomainducedwithcottonballinrats .ConclusionThewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaehassignificantantiinflammatoryeffects. Keywords:RadixetCaulisIlicisAsprellae;waterextract;antiinflammatory;micinflammatory;mic e 岗梅是冬青科植物梅叶冬青 Ilexasprella(Hook.etArm.)champ.exBenth.的干燥根 及茎。其味苦、微甘、性凉。有清热解毒、生津止渴、利咽消肿、散瘀止痛之功,常用于感 冒发热、肺热咳嗽、热病津伤口渴等[1]。岗梅主产于两广地区(广东、广西),是多种凉茶中 的主要药味,应用较广。但目前尚未见有关岗梅水提取物抗炎作用的系统报道,笔者对岗梅 水提取物进行抗炎作用的动物实验研究,报告如下。 1 材料与方法 1.1 药物及试剂岗梅水提取物采用水煎法自制,方法为:取适量岗梅,每次用 8 倍量水煎 煮 1h,共 2 次,合并 2 次水煎煮液,浓缩,备用;阿司匹林片:河北石家庄制药集团生产,批 号:041114;乌拉坦:国药集团化学试剂有限公司生产,批号:E60521;二甲苯:广东光华化学 厂有限公司生产,批号:20050218;角叉菜胶购自美国 Sigma 公司,批号:59C-0328;C-0328;青霉素 和链霉素混合液(每毫升含 800U 青霉素和 650U 链霉素)。 1.2 动物昆明种小鼠,雄性,体质量 20~24g,SPF 级,由第一军医大学实验动物中心提供, 动物合格证号:2004A063 号;SD 大鼠,雄性,体质量 150~180g,清洁级标准,由中山大学实 验动物中心提供,动物合格证号:粤检证字 2003A070。 1.3 仪器大鼠足跖容积测定装置,参照文献[2]方法定制。 1.4 方法 1.4.1 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响[2]取昆明种小鼠 60 只,随机分为正常对照组、 模型对照组、岗梅水提取物低、中、高剂量组、阳性对照药物(阿司匹林)组,共 6 组,每组 10 只,实验前小鼠禁食不禁水 12h,然后各组小鼠按 0.1mL/10g 体质量灌胃给药,1 次/d,共 7d,其中正常对照组和模型对照组给等体积蒸馏水。末次给药后 30min,除正常对照组外, 其余各组小鼠于右耳正反两面涂上二甲苯 50μLL 致炎,致炎 1h 后脱颈椎处死动物,用直径 9C-0328;mm 打孔器冲下左耳和右耳同一部位的圆片,于分析天平上称重,以两耳片重差值为炎症肿 胀度。 1.4.2 对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀及炎症组织中 PGE2(前列腺素 E2)的影响[2]取 SD 大鼠 50 只,随机分为空白对照组、岗梅水提取物低、中、高剂量组、阳性对照药物(阿司匹 林)组,共 5 组,每组 10 只。实验前大鼠禁食不禁水 12h,然后各组大鼠按 1mL/100g 体质 量灌胃给药,1 次/d,共 7d,其中空白对照组给等体积蒸馏水。末次给药后 1h,先按容积测定 方法测量各鼠右踝关节以下容积,然后于各鼠右后足跖皮下注射 ρ=1%角叉菜胶 0.1mL 致 炎,分别于致炎后 1h、2h、3h、4h 时,按原法测量右踝关节以下容积。测完后,颈椎脱臼处 死大鼠,于踝关节上 0.5cm 处剪下炎性肿胀足称重,将以上剪下的致炎足剥皮,剪碎放入 5mL 生理盐水中浸泡 1h 后,离心足浸出液,取上清液 0.1mL,加 0.5mol·L-1KOH-甲醇液 2mL,在 50℃下异构化 20min,用甲醇稀释至 5mL,于波长 278nm 处测定吸光度(A)值,A 值的大小反应 PGE2 的含量。 1.4.3 对大鼠棉球肉芽肿的影响[3]取 SD 大鼠 50 只,每只大鼠按 1g/kg 体质量腹腔注 射乌拉坦进行麻醉,在各鼠的左右蹊部用碘酒消毒,75%(φ))乙醇脱碘后,各切开 1cm 长小口, 用眼科镊子将已称重为 30mg 的灭菌脱脂棉球(直径 6.5~8.5mm)一个植入皮下,每个棉球 加青霉素和链霉素混合液 0.3mL,以防感染,随即缝合皮肤。将所有大鼠随机分为空白对照 组、岗梅水提取物低、中、高剂量组、阳性对照药物(阿司匹林)组,共 5 组,每组 10 只,实验 前大鼠禁食不禁水 12h,术后 2h 开始按 1mL/100g 体质量灌胃给药,其中空白对照组给等 体积蒸馏水,1 次/d,共 7d。在第 8 天杀死动物,打开原切口,将棉球连同周围结缔组织一起 取出,剥出周围已包裹肉芽组织的棉球,剔除脂肪组织,在 60℃烘箱放置 12h 后称重,减去原 棉球重量即为肉芽肿净重。 1.4.4 对醋酸致小鼠毛细血管通透性增高的影响[3]取昆明种小鼠 50 只,随机分为空白 对照组、岗梅水提取物低、中、高剂量组、阳性对照药物(阿司匹林)组,共 5 组,每组 10 只, 实验前小鼠禁食不禁水 12h,然后各组小鼠按 0.1mL/10g 体质量灌胃给药,1 次/d,共 7d,其 中空白对照组给等体积蒸馏水。末次给药后 1h,各组小鼠尾静脉注射 0.5%伊文思蓝生理盐 水溶液 0.1mL/10g 体质量,随即 ip0.6%(φ))醋酸 0.1mL/10g 体质量,20min 后,断头放血 处死小鼠,腹腔注射 6mL 生理盐水,轻揉腹部,收集腹腔洗出液,1000r/min 离心 5min,取上 清液用紫外-可见分光光度计于 59C-0328;0nm 处测吸光度值(A 值)。 1.5 统计学处理实验数据以±ss 表示,采用 SPSS 统计软件进行统计学处理,以 P<0.05 为差异有显着性。 2 结果 2.1 岗梅水提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响岗梅水提取物中、高剂量组的耳重 差与模型组比较,差异具有显着性(P<0.01),说明岗梅水提取物能抑制二甲苯所致的小鼠耳 廓肿胀,提示岗梅水提取物对急性炎性肿胀具有抑制作用。见表 1。 2.2 岗梅水提取物对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀及炎症组织中 PGE2 含量的影响低、中、 高剂量岗梅水提取物对角叉菜胶致炎后 1h、2h、3h、4h 时大鼠的足跖肿胀及炎症组织中 PGE2 含量增加均具有明显的抑制作用(P<0.05 或 0.01),提示岗梅水提取物对急性炎性肿 胀具有显着抑制作用。见表 2。 2.3 岗梅水提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响岗梅水提取物低、中、高剂量组的棉球肉 芽肿净重与空白对照组比较,差异具有显着性(P<0.05 或 0.01),说明岗梅水提取物组能明 显抑制大鼠棉球肉芽肿的形成,提示岗梅水提取物具有一定的抗炎作用。见表 3。 2.4 岗梅水提取物对醋酸致小鼠毛细血管通透性增高的影响岗梅水提取物低、中、高 剂量组腹腔洗出液的吸光度值与空白对照组比较,差异具有显着性(P<00505 或 0.01),说明 岗梅水提取物组能明显抑制醋酸致小鼠毛细血管通透性增高,提示岗梅水提取物对炎性过程 中毛细血管通透性增高具有一定的抑制作用。见表 4。 表 1 岗梅水提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(略) Tab.1TheeffectsofthewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaeonxylen e-inducedearedemainmice 与模型对照组比较:**P<0.01;与正常对照组比较:#P<0.01(tP<0.01(t 检验) 表 2 岗梅水提取物对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀及炎症组织中 PGE2 含量的影响(略) Tab.2TheeffectsofthewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaeonhindp awedemaandPGE2increaseinducedwithcarrageeninrats 与空白对照组比较:*P<0.05;**P<0.01(t 检验) 表 3 岗梅水提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响(略) Tab.3TheeffectsofthewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaeongranu lomainducedwithcottonballinrats 与空白对照组比较:*P<0.05;**P<0.01(t 检验) 表 4 岗梅水提取物对醋酸致小鼠毛细血管通透性增高的影响(略) Tab.4TheeffectsofthewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaeoncapill arypermeabilityincreaseinducedwithaceticacidinmice 与空白对照组比较:*P<0.05;**P<0.01(t 检验) 3 讨论 岗梅为两广地区的药材,有清热解毒、生津止渴、利咽消肿、散瘀止痛之功,民间多用 于凉茶。关于岗梅现代研究的文献报道较少,化学研究表明:岗梅中含有三帖皂苷、内酯、 生物碱、赪酮甾醇、赪酮甾醇 3inflammatory;micOinflammatory;micβDinflammatory;micDinflammatory;mic葡萄糖苷、丁香脂素、丁香脂素inflammatory;micOinflammatory;micβDinflammatory;micDinflammatory;mic葡萄糖苷 和 19C-0328;inflammatory;mic去氢乌索酸。现代药理学研究表明:岗梅在体外试验中对金黄色葡萄球菌、溶血性链 球菌有抑制作用;可增加豚鼠离体心脏冠脉流量和心收缩力;对垂体后叶素所致家兔急性心 肌缺血 T 波改变有保护作用[1,4]。但与岗梅“清热解毒”功效密切相关的抗炎作用未见系统 的研究报道。 炎症是机体活组织在各种损伤刺激下所表现的以防御为主的反应,炎症渗出、组织肿胀 是炎症早期的重要指标,在炎症晚期和慢性炎症期,表现为巨噬细胞和成纤维细胞增生,形成 肉芽组织[5]。 本研究采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法、角叉菜胶致大鼠足跖肿胀法、大鼠棉球肉芽肿 法和醋酸致小鼠毛细血管通透性增高法等经典动物实验方法,考察岗梅水提取物对炎症发生 的早期和晚期的影响。结果表明:岗梅水提取物既可抑制炎症早期的水肿和渗出,又可抑制 炎症晚期的组织增生和肉芽组织的生成,且能降低局部炎症组织中 PGE2 含量,提示岗梅水 提取物具有显着的抗炎作用,且其抗炎机制之一可能与减少炎症组织中 PGE2 合成有关。本 研究对岗梅清热解毒的功效进行了有益的探索,其实验结果为岗梅及相关凉茶的应用提供了 一定的实验依据,但岗梅水提取物抗炎的作用机制及水提取物中发挥抗炎的物质基础尚需进 一步研究。 【摘要】目的建立测定兔血浆中葛根素浓度的液相色谱串联质谱法。方法血浆加入内inflammatory;mic串联质谱串联质谱法。方法血浆加入内法。方法血浆加入内 标橙皮苷后经固相萃取处理,采用 AglientC18 柱(150mm×2.1mm,3.5μLm)分离,流动相 为甲醇inflammatory;mic10mmol·L-1 醋酸铵缓冲液inflammatory;mic乙腈(体积比 70∶20∶10),流速为 0.2mL·min-1。样品 在串联质谱串联质谱法。方法血浆加入内中经 ESI 源离子化后以多反应离子监测方式测定。结果葛根素在 10~3000ng·mL-1 线性良好(r=0.9C-0328;9C-0328;86),检测限为 10ng·mL-1,回收率为 9C-0328;9C-0328;.9C-0328;1%~103.9C-0328;2%,绝对回收率为 9C-0328;1.33%~100.40%,日内、日间变异(RSD)均≤15%, 色谱串联质谱法。方法血浆加入内峰保留时间为 1.67min。结论方法灵敏、准确、快速、特异性强,适用于中药葛根素 的药动学研究。 【关键词】液相色谱串联质谱法。方法血浆加入内inflammatory;mic质谱串联质谱法。方法血浆加入内法;葛根素;血药浓度 Abstract:ObjectiveToestablishanHPLCinflammatory;micMSinflammatory;micMSmethodfordeterminingthecon tentofplasmapuerarin.MethodsTheplasmasamplepretreatedwithsolid inflammatory;micphaseext ractionafteradditionofinternalstandardofhesperidinwasanalyzedonanAglientC1 8column(150mm×2.1mm,3.5μLm).Themobilephaseconsistedofmethanol inflammatory;mic10mm ol·L-1NH4ACbufferinflammatory;micacetonitrile(70∶20∶10)withtheflowrateof0.2mL·min1.Thesamplewasionizedbyelectrosprayionizationsourceinthetriplequadrupletan demmassspectrometer,then,itwasquantitatedwithmultiplereactionmonitoring mode.ResultsTherewasagoodlinearityovertheconcentrationrangesof10~3000n g·mL-1(r=0.9C-0328;9C-0328;86).Thedetectionlimitofthismethodwas10ng·mL1.Therecoveryandabsoluterecoverywere9C-0328;9C-0328;.9C-0328;1%~103.9C-0328;2%and9C-0328;1.33%~100.40 %,respectively.Thewithininflammatory;micdayandbetweeninflammatory;micdaydeviationswerelessthan15%andt hechromatographypeaktRwas1.67min.ConclusionThemethodissensitive,accur ate,rapidandsuitableforthedeterminationofpuerarininhumanplasma. Keywords:liquidchromatographytandemmassspectrometry;puerarin;plasmaconcentration 葛根素(puerarin)是中药葛根的主要成分之一,具有扩张冠脉血管、降低血压和心肌耗 氧量、抗心律失常等作用[1]。文献报道的葛根素血药浓度测定方法多数是高效液相色谱串联质谱法。方法血浆加入内法 [2-4],但有时也难以满足药动学研究中微量血药浓度的测定要求,且分析用时较长。本文建 立测定葛根素血药浓度的液相色谱串联质谱法。方法血浆加入内inflammatory;mic串联质谱串联质谱法。方法血浆加入内(LCinflammatory;micMSinflammatory;micMS)法,具有简便、灵敏度高、特异性 强且检测快速等优点,适用于葛根素的药动学研究。 1 材料与方法 1.1 仪器与试药美国 AB 公司 API3000 型液质联用系统;Waters20 管型固相萃取 仪;TECHNE 样品浓缩仪;WatersHLB 固相萃取小柱(100mg)。葛根素注射剂(浙江康恩贝 制药股份有限公司,0.25g/5mL);葛根素、橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号分 别为:0752inflammatory;mic200108,0721inflammatory;mic200104);甲醇、乙腈为色谱串联质谱法。方法血浆加入内纯;醋酸胺为分析纯;重蒸馏水。 1.2 色谱串联质谱法。方法血浆加入内及质谱串联质谱法。方法血浆加入内条件色谱串联质谱法。方法血浆加入内柱:AglientC18(150mm×2.1mm,3.5μLm),流动相:甲醇 inflammatory;mic10mmol·L-1 醋酸铵缓冲液inflammatory;mic乙腈(体积比 70∶20∶10),流速为 0.2mL·min-1。辅助气化电 喷雾离子源(ESI),多反应离子监测(MRM)模式正离子检测,检测离子对:m/ z417.2→267.2(葛根素),m/z611.2→303.2(内标橙皮苷),辅助气化气流量:7500CC·min1,雾化气流量:8L·min-1,气帘气流量:8L·min-1,碰撞气流量:6L·min-1,离子源喷雾电 压:5500V,离子源雾化温度:350℃。 1.3 对照品及内标溶液的配制精密称取适量的葛根素对照品,用甲醇溶解并定容得 160μLg·mL-1 的对照品溶液;精密称取适量的橙皮苷对照品,用甲醇溶解并定容得 500ng·mL-1 的内标溶液。 1.4 血浆样品处理固相萃取小柱用 1.0mL 甲醇活化和 1.0mL 双蒸水平衡,取血样 300μLL 加入 10mmol·L-1 醋酸铵缓冲液 300μLL 和内标溶液 20μLL,混匀后上样,双蒸水 1.0mL 洗涤,0.5mL 甲醇洗脱,收集洗脱液于 45℃水浴下用 N2 吹干浓缩,加入 150μLL 流动 相复溶,取 5μLL 进样。 2 结果 2.1 方法专属性根据葛根素和内标物橙皮苷的子离子质谱串联质谱法。方法血浆加入内扫描结果(见图 1),分别选择 特异的 m/z417.2→267.2 和 m/z611.2→303.2 用于定量监测。按照血浆样品处理方法 和检测条件,空白血浆的色谱串联质谱法。方法血浆加入内图、空白血浆加葛根素和内标对照品的色谱串联质谱法。方法血浆加入内图、用药后血浆色 谱串联质谱法。方法血浆加入内图,分别见图 2A、图 2B 和图 2C。结果表明,葛根素和内标物的保留时间分别为 1.67min 和 1.75min,血浆中无内源性物质和基质效应干扰,方法特异性强。 图 1 葛根素(1)和橙皮苷(2)的质谱串联质谱法。方法血浆加入内子离子扫描图(略) Fig.1FullscanMS-MSspectraofpuerarin(1)andhesperidin(2) A.空白血浆;B.空白血浆加入葛根素和橙皮苷对照品;C.兔给药后血浆 1.葛根素 m/z417.2→267.2,tR=1.67min;2.橙皮苷 m/ z611.2→303.2,tR=1.75min 图 2 血浆中葛根素和橙皮苷的色谱串联质谱法。方法血浆加入内图(略) Fig.2ChromatogramsofpuerarinandhesperidininplasmabyLCinflammatory;micMSinflammatory;micMS 2.2 标准曲线及线性范围取空白血浆加入葛根素对照品溶液,配制成浓度为 10、30、100、300、1000、3000ng·mL-1 的血浆标准曲线样品,按“1.4”项下方法操作, 计算葛根素与内标峰面积比,得回归方程为:Y=0.0029C-0328;9C-0328;C+00500234,r=0.9C-0328;9C-0328;86,权重 1/ X2。血浆中葛根素在 10~3000ng·mL-1 范围内与峰面积比线性关系良好,定量下限为 10ng·mL-1。