仙鱼汤对小鼠肺癌研究论文

【摘要】【目的】探讨具有健脾清肺、化痰祛瘀作用的中药复方仙鱼汤对小鼠 Lewis 肺癌生长的抑制作用及其相关的分子机制。【方法】将 50 只 Lewis 肺癌荷瘤小鼠分为仙 鱼汤高、中、低剂量组(剂量分别为 1.747、0.874、0.437g·kg-1·d-1),环磷酰胺(CTX)) 组(剂量为 20mg·kg-1·d-1),荷瘤模型组;计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率;制备单细胞 悬液,采用流式细胞仪检测各组小鼠 Lewis 肺癌细胞周期、细胞凋亡率;采用免疫组化法检 测各组 Lewis 肺癌小鼠的 bcl222 基因的表达。【结果】仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组 瘤体质量均低于模型组,肿瘤细胞凋亡率均高于模型组(P<0.05 或 P<0.01),仙鱼汤各组随 着药物剂量的增大,抑瘤率和肿瘤细胞凋亡率逐渐增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组处于 S 期的细胞比例均低于模型组(P<0.05 或 P<0.01),呈现明显的 G0/G1 期阻滞现象。 仙鱼汤各剂量组 bcl222 染色强度指数显着低于模型组(P<0.01)。【结论】仙鱼汤具有抑制 小鼠 Lewis 肺癌生长的作用,其机理可能与通过降低 bcl222 表达从而促进肿瘤细胞凋亡有关。 【关键词】仙鱼汤/药理学肺肿瘤/中药疗法细胞凋亡基因表达调控细胞培养 肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,中医药在肺癌的治疗中发挥着越来越重要的 作用。仙鱼汤是治疗肺癌的经验方,具有健脾清肺、化痰祛瘀之功效,多年的临床应用已证 实其具有较好的临床疗效[1-2]。本研究通过动物实验,进一步研究了仙鱼汤对小鼠 Lewis 肺癌生长的抑制作用,并从诱导肿瘤细胞凋亡及调控凋亡相关基因的角度探讨其作用机理。 现报道如下。 1 材料与方法 1.1 动物 C57BL/6J 小鼠,雌雄各半,体质量 18~22g,SPF 级,由广州中医药大学实验动 物中心提供(合格证号:0020535)。 1.2 瘤株小鼠 Lewis 肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供,广州中医药大学第一 附属医院中医肿瘤研究所长期移植传代。 1.3 药物与制备仙鱼汤组成:仙鹤草 15g,鱼腥草 30g,猫爪草 30g,山海螺 30g,党参 15g,三七片 10g,山慈菇 10g,浙贝母 15g,守宫 5g,天冬 15g,黄芪 30g,炙甘草 5g。由广 州中医药大学新药研究中心制备,按照传统煎煮法煎煮,低、中、高剂量组药物浓度根据人 与动物体表面积与计量换算法计算[3],低剂量组 1.092g/mL,中剂量组 2.184g/mL,高剂量 组 4.368g/mL,分别相当于临床等效剂量的 1、2、4 倍。制备后于 4℃冰箱中贮存备用。 环磷酰胺(CTX))注射用粉针剂为山西普德药业有限公司产品(批号:20060206),200mg/支, 临用前用生理盐水溶解,稀释浓度为 2mg/mL,根据 CTX) 的半数致死量(LD50)为 472mg/ kg,注射用量为 LD50 的 1/3~1/5,故小鼠给药剂量设为 20mg·kg-1·d-1。 1.4 主要试剂与仪器碘化丙啶(PI))染液为晶美生物工程有限公司产品;bcl222 兔多克隆抗 体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色(SABC)试剂盒(SA1022)均为博士德生物工程有 限公司产品;RPMI)21640 培养基为 Gibco 公司产品;二甲苯、乙醇,均为市售分析纯;超净工 作台(苏净集团安泰公司);冷冻桌面离心机(Eppendorf5810RCentrifuge);解剖显微镜(北 京电子光学设备厂);37℃电热恒温水浴箱(上海恒丰仪器仪表有限公司);ALTRA 型流式细 胞仪(美国 Beckmancoul2ter 公司);CS2Ⅳ 型烤片机(孝感市电子仪器厂);亿鸣2200 病理图 像分析系统(中国亿鸣)。 1.5Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型复制于液氮罐中取出 Lewis 肺癌细胞株 1 支,置于 37℃ 电热恒温水浴箱内,轻轻摇动令其尽快融化。取出冻存管,用酒精消毒后开启,用吸管吸出细 胞悬液,注入离心管并滴加体积分数 10%小牛血清 RPMI)21640 培养基,常规离心,制成瘤细 胞混悬液,台盼蓝计数约为 1×107/mL 瘤细胞。消毒小鼠右前腋,取 0.2mL(约 1×106~2×106 个瘤细胞)接种于皮下。传代 3 次。在无菌条件下剥离 Lewis 肺癌荷瘤鼠 皮下瘤块,选取生长良好的瘤组织,剪碎、称质量,用细胞匀浆器制成匀浆,按体积比 1:3 加生 理盐水制成瘤细胞混悬液,接种于 C57BL/6J 小鼠右前肢腋窝皮下,每只 0.2mL(约 1×106~2×106 个瘤细胞)。 1.6 分组及给药接种 24h 后随机分为 5 组:仙鱼汤高剂量组(剂量为 1.747g/kg)、仙鱼 汤中剂量组(剂量为 0.874g/kg)、仙鱼汤低剂量组(剂量为 0.437g/kg)、CTX) 阳性对照组 (剂量为 20mg/kg)、荷瘤模型组。中药各组均予以 0.4mL 中药灌胃,CTX) 组予以 0.2mL 腹腔注射,荷瘤模型组予以 0.4mL 生理盐水灌胃,均每日 1 次,给药 14d。 1.7 观察指标及检测方法 1.7.1 小鼠生活状态观察实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。 1.7.2 抑瘤率末次给药后 24h,Lewis 荷瘤小鼠颈椎脱臼处死,用眼科剪分离剥取肿瘤, 电子天平称质量,计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率[4]:p 抑瘤=(1-m 实验组/m 模型组) ×100%。 1.7.3 细胞周期分析及细胞凋亡检测取小块瘤组织,加入生理盐水洗净血迹后倒掉,再加 入 1mL 生理盐水,用眼科剪剪碎组织,吸管轻轻吹打,过 300 目筛,收集单细胞悬液于流式专 用管,加入 2mL 中性磷酸盐缓冲溶液(PBS),1300r/min 离心 5min 洗涤 2 次,调整细胞计 数约 1×106/mL,加入体积分数 70%冰乙醇 2mL 吹打后封口固定,保存于 4℃冰箱 24h。 将固定的单细胞悬液离心,去固定液,加入 PBS 重新悬浮,洗涤 2 次,300 目筛网过滤 1 次,加 入 1mLPI) 染液(终浓度 100mg/L),4℃避光染色 30min,流式细胞仪检测,收集 50000 个细 胞,应用 mul2ticycl2e 软件分析凋亡率[5]。 1.7.4 病理检查肿瘤组织经体积 分数 10%福尔马林固定 24h 后常规石蜡包埋,4μmm 厚连续切片,苏木素-伊红(HE)染色, 光镜观察肿瘤生长、肿瘤坏死、间质反应和肿瘤及肿瘤周围组织炎症细胞浸润情况并摄片。 1.7.5bcl222 阳性表达检测采用免疫组化法。常规石蜡包埋后,4μmm 厚连续切片,行 SABC 法免疫组织化学染色,用 PBS 液代替一抗做阴性对照。光学显微镜下观察,bcl222 蛋白 染色细胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野(400)下随机计数 5 个视野。计算出各组的染 色强度指数(stainingintensityindex,pSI)I))。pSI)I)=(pA 强度瘤细胞×0)+(pB 强度瘤细胞 ×1)+(pC 强度瘤细胞×2)+(pD 强度瘤细胞×3)。其中 A 强度代表细胞浆无特异性染色;B 强度代表细胞浆呈特异性浅棕黄色,染色较浅;C 强度代表细胞浆呈特异性棕黄色;D 强度代 表细胞浆呈特异性深棕色,染色较深。染色强度指数(pSI)I))的范围在 0~3[6]。 1.8 统计学分析采用 SPSS11.5 统计软件处理。 2 结果 2.1 一般状况的观察实验结束后,模型组、CTX) 组小鼠表现为身体瘦小,活动少,喜聚群, 毛发缺少光泽;CTX) 组小鼠于实验 5~7d 开始出现脱毛,进食减少;仙鱼汤高、中、低剂量组 小鼠脱毛现象少于 CTX) 组及模型组,活动力优于 CTX) 组及模型组。 2.2 各组抑瘤率比较表 1 结果表明,仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组瘤体质量均低于 模型组(P<0.05 或 P<0.01)。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大,瘤体质量逐渐减轻,抑瘤率 逐渐增高。 表 1 各组 Lewis 肺癌小鼠的瘤体质量及抑瘤率比较(略) Tabl2e1Comparisonoftumormassweightandtumor2inhibitoryrateindifferentg roups 统计方法:单因素方差分析;①P<0.05,②P<0.01,P<0.05,②P<0.01,与模型组比较 2.3 各组细胞凋亡率及细胞周期分析仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组小鼠 Lewis 肺 癌细胞凋亡率均高于模型组(P<0.05 或 P<0.01),各仙鱼汤组随着剂量的增大,凋亡率亦逐 渐增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组处于 G0/G1 期细胞的比例均高于模型组,其中 仙鱼汤高剂量组、CTX) 组与模型组比较,差异有显着性意义(P<0.01)。仙鱼汤高、中、低 剂量组及 CTX) 组处于 S 期细胞的比例均显着性低于模型组(P<0.05 或 P<0.01),呈现明显 的 G0/G1 期阻滞现象。仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组处于 G2/M 期细胞的比例与模 型组比较,差异无显着性意义(P>0.05)。结果见表 2、图 1。 2.4 光镜观察模型组癌细胞大小和形态很不一致,可见瘤巨细胞;癌细胞核体积增大,细 胞核和细胞浆比例增大,核的大小、形状、染色不一,可见巨核、多核,核染色深,核染色质呈 粗颗粒状,分布不均匀;核仁肥大,数目增多,核分裂相增多,可见不对称性、多极性及顿挫性 等病理性核分裂相,间质内淋巴细胞少见(图 2-a)。CTX) 组可见大片坏死,间质见较多的淋巴 细胞等炎细胞浸润,纤维组织反应性增生(图 2-b)。仙鱼汤各剂量组可见癌巢内坏死面积增 大,间质可见淋巴细胞等炎细胞浸润,可见较多的细胞凋亡小体(图 2-c、d、e)。 2.5 各组 bcl222 染色强度指数凋亡相关基因 bcl222 的阳性产物主要位于细胞浆,可见大 量的细胞浆棕黄色颗粒染色。仙鱼汤各剂量组 bcl222 的染色强度指数均显着低于模型组 (P<0.01),并呈剂量依赖性,而 CTX) 组与模型组比较差异无显着性意义(P>0.05)。结果见 表 3、图 3。 表 2 各组小鼠 Lewis 肺癌组织的细胞凋亡率及细胞周期分析(略) Tabl2e2Comparisonofcel2l2apoptosisratioandcel2l2cycl2eanal2ysisindifferentgroup s 统计方法:单因素方差分析;①P<0.05,②P<0.01,P<0.05,②P<0.01,与模型组比较 a.模型组 b.CTX) 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组 图 1 各组凋亡率检测流式细胞图谱比较(略) Figure1Resul2tsofcel2l2apoptosisratiodetectedbyflowcytometerindifferentgro ups a.模型组 b.CTX) 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组 图 2 各组肿瘤组织形态比较(HE 染色,×400)(略) Figure2Morphol2ogical2changesoftumorcel2l2sunderl2ightmicroscopeindifferent groups(HEstaining,×400) a.模型组 b.CTX) 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组 图 3 各组 bcl222 阳性表达比较(免疫组化,×400)(略) Figure3Positiveexpressionofbcl222indifferentgroupsdetectedbyimmunohisto chemical2method 表 3 各组 bcl222 染色强度指数比较(略) Tabl2e3Comparisonofstainingintensityindexofbcl222indifferentgroups 统计方法:单因素方差分析;①P<0.05,②P<0.01,P<0.01,与模型组比较 3 讨论 多数学者认为,肺癌发生发展的中医病机可以用"痰、瘀、虚"3 个字高度概括。其中正 虚是肺癌发生的基础,《医宗必读》云:"积之成者,正气不足,而后邪气踞之。"正虚又以脾虚 为主,"脾为生痰之源,肺为贮痰之器"。正是脾虚导致痰浊内生,进一步血停成瘀,瘀血内生,痰 瘀内阻,蕴积肺部,日久而发为本病。 广州中医药大学陈锐深教授从肺癌病因病机出发,以健脾清肺、化痰祛瘀为治疗 大法,自拟了治疗肺癌的经验方"仙鱼汤"。方中君药为党参,具有补中益气、健脾益肺、 生津养血的功效,为补益肺脾气之要药。黄芪配合党参,以补肺脾之气;浙贝母清热化痰、开 郁散结;猫爪草散结消肿;三七片化瘀散结止痛,共为臣药。仙鹤草收敛止血、解毒抗癌;鱼腥 草清热解毒、消痈排脓;天冬养阴清肺生津;山海螺解毒消肿、排脓祛痰;山慈菇清热解毒、 化痰消肿散结;守宫散结止痛,共为佐药。炙甘草调和诸药,为使药。综合全方,扶正祛邪,攻 补兼施,使祛邪而不伤正,共奏健脾清肺、化痰祛瘀之功效。 肿瘤的发生和发展不仅与肿瘤细胞的增殖、分化异常有关,而且与细胞凋亡的调控失常 有关。人类细胞的凋亡机制十分复杂,目前已鉴定出了构成凋亡途径的多种成分,揭示出凋 亡是受多种基因调控的,例如 p53、p16、c2myc、bcl222、bax 等相关基因均参与了细胞 凋亡的调控[7]。bcl222 是一种凋亡相关基因,被激活的 bcl222 基因的主要作用是抑制细胞凋 亡,下调 bcl222 基因的表达,对肿瘤细胞有显着的生长抑制作用。bcl222 可能通过阻断凋亡的 公共信号传递通路(如抑制线粒体释放细胞色素 C)达到抑制或阻断多种细胞及细胞系的细 胞凋亡过程。随着该基因蛋白产物的过度表达,使得细胞增殖与凋亡的平衡发生紊乱,从而 阻断细胞凋亡的最后共同通道,从而抑制细胞凋亡,导致癌变[8-11]。 本研究通过动物移植性肿瘤实验法探讨仙鱼汤对 Lewis 肺癌生长及肿瘤细胞凋亡的作 用。结果表明,仙鱼汤具有一定的抗肿瘤作用,而且其抑瘤作用随着剂量的增加而增强。从 HE 染色的病理切片中发现,不同剂量仙鱼汤组可见癌巢内坏死面积增大,间质可见较多的淋 巴细胞等炎细胞浸润,可见较多的细胞凋亡小体。进一步采用流式细胞仪检测凋亡率,结果 表明仙鱼汤具有促进小鼠 Lewis 肺癌细胞凋亡的作用,并且随着剂量的增加作用也逐渐增强。 仙鱼汤各剂量组处于 G0/G1 期细胞的比例均高于模型组,处于 S 期细胞的比例均低于模型 组,呈现明显的 G0/G1 期阻滞现象,提示仙鱼汤可能使 G1 期细胞不能通过细胞周期检测点 进入 S 期,从而发生 G0/G1 期阻滞,阻断 DNA 复制,干扰肿瘤细胞周期正常进行,以起到抑制 肿瘤的作用。免疫组化检测结果显示,仙鱼汤各剂量组 bcl222 蛋白表达均显着低于模型组,并 随着仙鱼汤剂量的加大,肿瘤组织 bcl222 的染色强度指数也逐渐降低。本研究实验结果提示 仙鱼汤可能通过降低 bcl222 表达的途径促进肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用,对临床用药 具有一定的指导意义。 【关键词】中药功效用量配伍炮制 煎煮 许多中药无论单用还是配伍组方,均可随着用量的大小、配伍的变化、炮制的不同和煎 煮的各异,功效或有递增,或呈双向性,或表现出功能的多样性。 剂量大小不同,功效不同 同一味药,用量大小对其功效有极大的影响。 黄连、龙胆草,1~2g 小量应用,能清热健胃,增进食欲;3~6g 则燥湿、泻火、解毒;大剂 量应用则败胃,引起胃肠道反应而恶心呕吐。 甘草 1~5g 应用,起调和诸药作用;5~12g,温胃、补中、解毒;若用 30g 以上,有类似激 素样作用。 桂枝汤中,桂枝和白芍的用量相等,起和营卫解肌的作用;桂枝加白芍汤中,白芍的用量比 桂枝多 1 倍,则治疗太阳病误下,转属太阴,因而腹满时痛。 厚朴三物汤、小承气汤、厚朴大黄汤三方均由厚朴、大黄、枳实组成,因为三方中三药 的用量、君臣佐使地位变化,证治各异。 小承气汤以大黄为主,功能泻热通便;厚朴三物汤,以厚朴为主,功能行气消胀;厚朴大黄 汤,以厚朴、大黄为主,功在开胸泄饮。 柴胡在小柴胡汤中,用量大于其他药味 1 倍有余,用在透邪;在逍遥散中,用量与各药相等, 用在疏肝;在补中益气汤中,用量甚微,主要起升清作用。 现代药理研究证明黄芪对利尿和血压的作用,剂量不同,功效相反。黄芪的利尿作用,用 量在 20g 以内明显,30g 以上趋于抑制。另外,对血压的改变,用量在 15g 以内可以升 压,35g 以上反而降压。 人参对血压的影响,也与黄芪类似,一般剂量有兴奋和升压作用,较大剂量则起抑制和降 压作用。 川芎小剂量能收缩子宫,兴奋心脏;大剂量则使子宫麻痹,心脏抑制。 配伍不同,功效不同 中药在临床治疗中大多以复方的形式出现,而同一种药在不同的方中因配伍不同,发挥 的功效也不同。 升麻在升麻葛根汤中与葛根配伍,表现为发表透疹作用,用于外感风热所致的头痛以及 麻疹初起,疹发不畅;在清胃散中与黄连、生地等配伍,清热散火解毒,用于治疗胃有积热所致 的牙龈肿痛、口舌生疮等症;在补中益气汤、升陷汤及举元煎中与人参、黄芪配伍则表现出 升阳举陷的作用,用于中气虚弱或气虚下陷诸证。 麻黄汤中桂枝与麻黄配伍起发汗解表作用,治疗风寒感冒;温经汤、桂枝茯苓丸中与当 归、川芎、桃仁配伍,温经活血、逐瘀消症,治疗月经后错或闭经不潮以及经行腹痛、腹部