阿魏酸糖酯抗氧化性研究论文

【摘要】本文测定了合成阿魏酸糖脂的抗氧化性,结果表明用 0.62%的阿魏酸糖脂浸 泡的苹果,阿魏酸葡糖酯抑制效应在处理后 4 天最明显,抑制率为 36.92%,阿魏酸木糖酯抑 制效应在处理后 8 天最明显,抑制率为 19.47%。对于果实的内源乙烯释放,经阿魏酸葡糖 酯和阿魏酸木糖酯处理的苹果分别推迟乙烯释放高峰期 6 天和 4 天。 【关键词】阿魏酸葡糖酯;阿魏酸木糖脂;抗氧化性;脂氧合酶 Theantioxygenationofferulaicacidglycolipide LVXiao-zhuo,JIANGWei,WUZanmin.SchoolofPublicHealth,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China 【Abstract】Theresistancetooxidationofsyntheticalferulaicacidglycolipidew asinvestigated.Theresultwasshown,applewasdippedin0.62%ferulaicacidglycoli pide,themostinhibitoreffectivenessofglucoseferulaicestersandxyloseferulaicest erwasshownrespectivelytobe36.92%afterfourdaysand19.47%aftereightdays,th efastigiumofreleaseethanewaspostponedrespectivelytobesixdaysandfourdays. 【Keywords】Glucoseferulaicesters;xyloseferulaicester;antioxygenation;Li poxygenase 植物的衰老行为中的主要矛盾是活性氧,乙烯的产生和脂氧合酶(Lipoxygenase,Lipoxygenase,简称 LOX)起了协同作用[1,2],所以抗氧保鲜剂,主要考察对脂氧化酶活性的抑制,及对乙烯的抑 制作用,这样可能达到预期的效果。由于阿魏酸及其衍生物是一种营养性的安全可靠的食品 添加剂,本文通过苹果考察了合成阿魏酸葡糖酯的抗氧化性,即利用紫外光谱和气相色谱法 系统的考察了阿魏酸对脂氧化酶活性的抑制和内源乙烯释放的抑制效果,通过测试证实阿魏 酸糖酯具有较好的抗氧化性,探索开发出一种安全高效的果蔬保鲜剂。 1 实验部分 1.1 实验药品与仪器阿魏酸葡萄糖酯,阿魏酸木糖脂(Lipoxygenase,天津工业大学提供);亚油酸(Lipoxygenase,化学 纯,许昌元化生物科技有限公司);氢氧化钠(Lipoxygenase,分析纯,天津市东丽区天大化学试剂厂);乙酸-乙 酸钠缓冲液(Lipoxygenase,0.1mol/L,pH4.6~5.8);磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(Lipoxygenase,0.1mol/ L,pH5.8~7.4);紫外光度计[UV-2401PC,岛津仪器(Lipoxygenase,苏州)有限公司];气相色谱仪(Lipoxygenase,GCAgilent6890N,美国安捷伦科技有限公司);高速离心机(Lipoxygenase,LG10-2.4A 型,北京医用离心机厂) 1.2 实验方法 1.2.1 苹果的处理将 5g 左右的合成阿魏酸葡糖酯或阿魏酸木糖酯加热溶于 800ml 去 离子水中待温度降至室温时,将反复洗过无伤、大小均一的最新市售的红富士苹果浸入到浓 度约为 0.62%的溶液中,待 5min 后取出,室温下放置待测。 1.2.2 底物的制备 10mmol/L 亚油酸钠(Lipoxygenase,反应底物)溶液的制取[3]:称取 70mg 的亚油 酸钠,7mlTritonX-100 和 4ml 无氧水,用 0.5mol/L 氢氧化钠滴定至溶液澄清,定容 25ml, 分装于 1.5ml 的安瓿瓶中,-18℃保存备用。 1.2.3 粗酶液的提取称取 2.0g 果肉放入研钵中,在液氮中充分研磨,然后将研钵内的果 肉转移至离心试管中,取 9ml 缓冲液充分冲洗研钵后将其转至离心试管中。在 10000r/ min 下离心 15min,取上层清液。 1.2.4LOX 活性最适 pH 值的测定本文通过紫外分光光度计测定 LOX 活性最高时的 pH 值[4,5],具体方法是:将一定 pH 值的缓冲液作参比进行基线测定,然后取 0.025ml10mmol/L 亚油酸钠溶液,缓冲液 2.775ml 和相应缓冲液下酶液 0.200ml 混合 均匀,在 30℃恒温水浴中反应 1min。立即测定吸光度值 A1 并计时,过 1min 后,记录吸光 度值 A2。两次测量的差值(Lipoxygenase,A2-A1)为 ΔAA。 LOX 活性单位:酶活力果肉质量×反应时间 LOX 活性单位:ΔAOD234nm×g-1min-1 由于每次取果肉为 2.0g,ΔAOD=ΔA×10002ΔAA×10002 本实验以 1min 内 3ml 体系在 234nm 的吸光度增加 0.001 作为一个酶活力单位(Lipoxygenase,U), 波长设定为 234nm;测定不同缓冲液下的 LOX 活性,需要重新校正基线。 1.2.5 阿魏酸糖酯对 LOX 活性的影响分别提取未用阿魏酸糖酯处理的、用阿魏酸葡糖 酯处理的及用阿魏酸木糖酯处理的苹果果肉的粗酶液,将最适 pH 值的缓冲液倒入比色皿中, 进行基线测定,然后移取 0.025ml 亚油酸钠,缓冲液 2.775ml,酶液 0.200ml 于样品池中, 在 30℃恒温水浴中反应 1min,立即测量 A1 并计时,过 1min 后,再进行测量 A2,求出 ΔAA, 每隔 2 天进行测量 1 次,持续 22 天。 1.2.6 乙烯的定性与定量本实验中利用气相色谱通过纯乙烯对果肉释放的乙烯进行定 性和定量,定量分析采用气相色谱外标法[6]。 气相色谱条件[7]:进样量 8ml,检测器 FID。N2 流速:35ml/min,H2 流速:50ml/ min,AIR 流速:375ml/min,色谱柱温:50℃,进样口温度:120℃,检测器温度:150℃。 1.2.7 阿魏酸糖酯对乙烯释放量的影响将处理过的苹果,每次均匀取果肉 10g,放入 135ml 医用药瓶中,将瓶用胶塞封严。过 13.5h 后进行气相色谱测试,每次进样 8ml,通过 气相色谱的积分面积从标准曲线上查出对应的乙烯体积 x。 乙烯释放量(Lipoxygenase,y)=ΔA×10002释放乙烯的体积(Lipoxygenase,x)果肉质量×释放时间 [单位:nl/(Lipoxygenase,g·h)] 2 结果与讨论 2.1LOX 活性最适 pH 值的测定本文以离体烟台优级红富士苹果试验材料,在 pH4.8~7.4 范围内测定了 LOX 活性变化。从图 1 中可以明显看出最适 pH 值为 6.4,在 pH6.4 附近,LOX 活性也较高。因此应选 pH=ΔA×100026.4 为酶活性测定的 pH 值。 图 1 苹果中 LOX 最适 pH 值测定 2.2 未处理、葡糖酯处理、木糖酯处理的 LOX 活性变化从图 2 可以看出三个处理 LOX 活性总体都呈上升趋势,未处理的红富士苹果的 LOX 均高于木糖脂和葡糖酯,阿魏酸葡糖酯 抑制效应在处理后 4 天最明显,抑制率为 36.92%,16 天后开始上升。阿魏酸木糖酯抑制效 应在处理后 8 天最明显,抑制率为 19.47%,12 天后开始上升。 图 2 未处理、葡糖酯处理、木糖酯处 理的 LOX 活性变化由此可以得出阿魏酸葡糖酯和阿魏酸木糖酯对离体后的红富士苹果 的 LOX 活性有较好的抑制作用,且阿魏酸葡糖酯的抑制作用比阿魏酸木糖酯的效果要更好 一些。这是可能是由于葡糖酯有五个羟基,更容易使脂氧合酶失去活性,而木糖酯有 4 个羟 基,其抑制效果要逊于葡糖酯 2.3 未处理、葡糖酯处理、木糖酯处理的苹果乙烯释放量变化通过在相同色谱条件下 测定纯乙烯和果肉释放气体,证实释放气体为乙烯。并由不同浓度的纯乙烯做出标准曲线, 利用外标法对不同时间释放的乙烯进行定量。 图 3 未处理、葡糖处理、木糖酯处理的 苹果乙烯释放量变化 由图 3 可见,阿魏酸葡糖酯和阿魏酸木糖酯处理的苹果,明显抑制苹果果实内源乙烯发 生,分别推迟释放乙烯高峰期为 6 天和 4 天出现,而且后期抑制释放量仍是阿魏酸葡糖酯比 阿魏酸木糖酯的抑制作用效果更好一些。 3 结论 实验结果表明合成的阿魏酸葡糖酯和阿魏酸木糖酯对离体后的红富士苹果果实有一定 的抗氧化保鲜效果:其中对于果实的 LOX(Lipoxygenase,脂氧合酶)活性,阿魏酸葡糖酯抑制效应在处理后 4 天最明显,抑制率为 36.92%,阿魏酸木糖酯抑制效应在处理后 8 天最明显,抑制率为 19.47%,对于果实的内源乙烯释放,阿魏酸葡糖酯和阿魏酸木糖酯分别推迟乙烯高峰期 6 天 和 4 天出现。结果表明阿魏酸葡糖酯的抗氧作用比阿魏酸木糖酯的效果要更好。由于阿魏 酸本身无毒,所合成的糖脂也无毒无味,对人体没有副作用,可以预测该类型的食品保鲜剂的 开发具有广阔的前景。 【关键词】中药 中药重金属元素的研究近几年发展迅速,引起了国内外广大学者的重视。这一新兴的边 缘学科已取得了很多的有益成果,其中有些成果对指导临床合理用药和保障中药的安全有效 具有重要的意义和启示。 含重金属类矿物药的应用历史 在我国安阳出土的 3000 多年前商代的甲骨文中,就载有朱砂,据考证这是公元前 1566~1120 年间的古物。这证明早在公元前 1000 多年我国古代劳动人民就利用过朱砂。 在长沙马王堆出土的我国现在发现的最古医书《五十二病方》中,记载了 21 种矿物药,其中 包括雄黄。《五十二病方》据考证可能是公元前 1000 年左右西周时代的产物。它不但记 载了这么多矿物药,还有以矿物药组成的方剂。《山海经》是我国古供书籍之一,据考证是 春秋时代的作品,其中记载矿物药 4 种,有朱砂、砒霜等。世界上第一部本草书《神农本草 经》(Lipoxygenase,公元前 1 世纪)记载了矿物药 46 种,并分上中下三品。其中有关于汞制(Lipoxygenase,水银、轻粉、 朱砂)和砷剂(Lipoxygenase,砒石、雄黄、雌黄)的记载。 《雷公炮炙论》对药物的采集、加工、修冶一直指导着药物的加工炮制,是我国医这史 上最早的一部制药专着。此时就知道矿物药炮炙加工中的煅和水飞法。这些炮制方法可以 提高有效微量元素的含量,降低有毒微量元素的含量。 宋代(Lipoxygenase,公元 1076 年)的“太医局卖药所”是世界上最早的药局。在唐·王焘的《外治秘要 方》中,矿物药朱砂、雄黄等已见于方剂中。 明代缪希雍的《神农本草经疏》中有矿物药 253 种,而李时珍(Lipoxygenase,1518~1593 年)着的 《本草纲目》,更是集前人之大成。书中共收集 1892 种药物,而矿物药则发展到 355 种,并 且都有比以前更祥细的记载和论述。 清朝以后至新中国成立前,有关重金属类矿物药的研究处于停滞阶段。新中国成立后, 特别是近十几年,有关重金属类矿物药的研究日趋深入和广泛,正在引起广大医药研究者的 关注与重视。 含重金属类矿物药对医学的贡献 我国矿物药的发现和应用,可以追溯到原始社会末期,人们从煮盐的过程中发现盐水明 目,芒硝泻下,从冶炼过程中发再现硫黄壮阳,水银杀虫。 《神农本草经》中有矿物药 46 种,分上中下三品,此时已经指出药物的相使、相须及相 畏、相反作用,也就是现代所产的协同和拮抗作用。《神农本草经》中有石胆,即胆矾“主明 目,目痛,金疮,诸痫症,女子阴蚀痛,石淋,寒热,崩中下血,诸邪毒气”的记载,有关铅类矿物药的 功能,《神农本草经》载“铅丹,味辛,微寒,主吐逆胃反,惊痫癫狂,除热下气”。认为朱砂“养精 神,安魂魄,益气,明目”,雄黄“主寒热,鼠瘘,恶疮,疽痔,死肌,杀百虫毒”。由此可见,2000 多年 前,我国人民就对含重金属类矿物药有了如此深刻的认识,并用于治疗疾病。 明代医药学家李时珍,用 30 年时间,积累和总结了劳动人民同疾病作斗争的经验,写成 了医药学巨着《本草纲目》。它概括和总结了我国 16 世纪以前历代的药学理论和实践经 验,并发展到一个新的高度,达到当时世界先进的医药科学水平。其中收载矿物药 355 种,对 含重金属类矿物药的功能主治,毒性大小,临床应用均有了进一步的认识。 从上述讨论中可以看出,含重金属类矿物药对人类的贡献是巨大的。在治疗当时的疑难 病证方面功不可没。 中药中重金属元素存在状态研究 随着人类对微量元素认识的不断深化,微量元素的作用也已成为人们进一步研究探讨中 医药学的一个新观点。 中药中重金属存在状态:为了全面深入地探讨中成药中微量重金属元素的作用,本文所 讨论的重金属元素存在状态,当是一个广义的概念。微量重金属状态主要指游离态和配合态。 重金属元素不同存在状态与生物活性的关系:中成药中重金属元素的生物活性只有在其 被人体吸收后才能表现出来。重金属元素的存在状态首先直接影响了它在人体的生物利用 度,从而对人体的机能产生程度不同的作用,表现为人体有益或有害。牛黄解毒片、六应丸、 喉症散等相当一部分中成药中都含有雄黄(Lipoxygenase,以硫化亚砷 As2S2 为主要成分),雄黄含砷量很 高,而砷是一种剧毒物质。 影响重金属元素存在状态的因素:中成药制剂工艺是影响其重金属元素存在状态的重要 因素。同一处方的药物,剂型不同,其微量元素存在状态及含量也会有所不同。以八珍方为 例对不同制剂的微量元素含量进行了测定,结果表明对同一元素,蜜丸中含量很高,其次为汤 剂、冲剂、口服液。造成上述现象的原因在于制剂工艺。丸、散剂多含有大量的原药材料 末,微量元素损失较少,状态受到影响也较小,而经过了水或醇处理后的液体剂型,微量元素则 会有较多变化或损失。在制剂过程中的一系列反应,如络合作用的产生等,影响了重金属元 素在制剂中的存在状态、溶出率,从而直接影响了制剂的生物活性。 重金属元素存在状态研究的定义:研究中成药中重金属元素存在状态是揭示其生物活性 的核心和关键,只有通过研究探讨重金属元素发挥药效或不良反应的机理,才能进一步地去 利用其治疗疾病或降低毒性。现在随着科学的发展和研究的深入,已有许多成功的例子。如: 铜与芦丁本身对癌细胞并无杀伤作用,但是芦丁和铜的络合物对癌细胞的杀伤作用却较大。 又如:硒是一种稀散元素,近年来人们发现硒和人体有密切关系。一方面,硒及其化合物都是 剧毒的,硒的氢化物毒性更强,长期大量吸入,可引起急性和慢性中毒,如肝大,对细胞代谢氧 化也有抑制作用。另一方面,硒又有营养价值和特殊功能,是谷胱甘肽过氧化酶的组成部分, 是人类必须的微量元素之一,可以对抗各种金属的毒性,对抗化学致癌,保护放谢性造成的损 失。最近又发现硒是具有生命功能的酶系统蛋白的关键成分。人们因此研制出硒酵母,既降 低了毒性,又可用于防癌。 总之,通地对中成药重金属元素状态的研究,有助于我们发现中成药及其重金属元素的 作用机理,从而为我们进一步提高疗效,降低毒性,开发新药提供了机会。中药重金属研究尤 其对有毒重金属的存在状态研究才刚刚开始,笔者认为如果按前述指导原则和方法论进行工 作,尤其在我们所提出的重金属元素的正确研究思路和中药有效化学成分的配位化学学说指 引下,重金属元素的研究必将逐步深入,不断取得丰硕成果,为中医药做出更大贡献。