麻竹叶黄酮研究论文

【摘要】目的利用麻竹叶黄酮进行了小鼠急性毒性实验和致突变实验。方法采用急性 毒性实验、小鼠精子畸形实验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验和鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动 物微粒体实验。结果小鼠经口 LD50>25g·（kg·bw）-1，腹腔注射腹腔注射 LD50>10g·（kg·bw）1；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变 没有对小鼠骨髓细胞染色体的断裂效应及纺锤体毒效应；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变也对小鼠精子的畸形无影响。结 论竹叶黄酮是一种安全的保健食品功能因子。但对人体有无毒副作用还需作临床实验。 【关键词】竹叶黄酮半数致死量 Amees 实验微核致突变作用毒理学 ToxicologicalTestonFlavonoidsfromLeavesofDendrocalamusLatiflorus Abstract:ObjectiveAcutetoxicityexperimentsandmutationexperimentswereconductedo nmicewiththeflavonoidsfromtheleavesofDendrocalamuslatiflorus.MethodsBymeansofacut etoxicitytest,malformationtestofmicesperm,micronucleustestofbonemarrowcellandAmeste st.ResultsLD50（ig）formicewasmorethan25g·（kg·bw）1andinLD50（ip）formicewasmorethan10g·（kg·bw）1.MutagenicactionofflavonoidfrombambooleavesonTA97，腹腔注射TA98，腹腔注射TA100andTA102，腹腔注射an dtoxiceffectonmicemarrowmicronucleusaswellaseffectonmalformationofmicespermwereal lnegative.ConclusionTheflavonoidsfromleavesofDendrocalamuslatifloruswasatypeofsecur efunctionfactorofhealthyfood，腹腔注射butwhetherithastoxicornegativeeffectonhumanornotitneedf urtherobservationinclinicalapplication. Keywords:Flavonoidsfrombambooleaves（FBL）；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变LD50；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变Amesexperiment；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变 Micronucleus；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变Mutationexperiments；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变Toxicology 麻竹 Dendrocalamuslatiflorus 又名甜竹、八月麻（福建），腹腔注射属禾本科牡竹属，腹腔注射是广泛 分布于我国福建、台湾、广东、广西、云南、贵州和四川等南亚热带和热带地区的大型丛 生竹种［1］。麻竹叶大，腹腔注射宽 4～7cm 以上，腹腔注射内含有丰富的营养物质，腹腔注射很值得开发利用。竹 叶在我国具有悠久的食用和药用历史［2～4］。竹叶提取物具有优良的抗自由基、抗氧化、 抗衰老、调节血脂、阻断亚硝化反应、增强免疫和抗菌抑菌的作用［2～4］。竹叶中所含 的功能因子主要是黄酮糖苷和香豆素类内酯等［3,4］。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验用竹叶黄酮系麻竹叶黄酮，腹腔注射本实验室自备［2］，腹腔注射总黄酮>80%。 1.1.2 实验动物昆明种小鼠：为 BALB/C 纯系小鼠（医动字 2004 第 002 号），腹腔注射♂，腹腔注射♀ 各半，腹腔注射8～10 周龄，腹腔注射体重 18～20g，腹腔注射由重庆市中药研究院实验动物中心提供。 1.1.3 菌株鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株 TA97，腹腔注射TA98（移码型突变株）和 TA100，腹腔注射TA102（碱基置换型突变株）：均由重庆市疾控中心提供。 1.2 方法 1.2.1 竹叶黄酮的经口（ig）、腹腔注射（ip）急性毒性（LD50）实验［5～7］采用霍 恩法。实验剂量以最大注射量或经口灌胃不超过 1ml/只小鼠为限。竹叶黄酮经口的剂量组 设 4 个组为 2.15，腹腔注射4.64，腹腔注射10.0，腹腔注射21.5g·（kg·bw）-1；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变竹叶黄酮经腹腔注射剂量组设 4 个组 为 1.00，腹腔注射2.15，腹腔注射4.64，腹腔注射10.00g·（kg·bw）-1。取健康小鼠，腹腔注射禁食 16h 后，腹腔注射给预受试物后观 察 7d，腹腔注射记录小鼠的活动和死亡情况。 1.2.2 竹叶黄酮的鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体实验（Ames 实验）［6,8～10］采 用平板渗入法。实验菌株采用 TA97，腹腔注射TA98（移码型突变株）和 TA100，腹腔注射TA102（碱基置 换型突变株），腹腔注射实验前菌种的 5 个遗传特征要作鉴定，腹腔注射达到规定的标准才能使用，腹腔注射并且在 实验前均要在营养肉汤培养基中，腹腔注射于 37℃水浴振荡培养 14h 增菌，腹腔注射得到大约 2×108 的菌 株悬浮液。按急性毒性实验所用腹腔注射最高剂量（10.00g/kg）的 1/10，腹腔注射1/20，腹腔注射1/40，腹腔注射1/80，腹腔注射1/160，腹腔注射1/320 设 6 个剂量组，腹腔注射另设阴性对照组（竹叶黄酮为 0mg/平皿）和阳性对照组（2-AF、敌克松、叠氮钠），腹腔注射共 10 个实验组，腹腔注射并各实验组分别 进行加 S9（20μl/l/平皿）活化和不加 S9 活化的实验，腹腔注射每次实验做 3 个平行样品，腹腔注射取两次实 验的平均数，腹腔注射以超过自然回变数（阴性对照组）的 2 倍作为阳性判断标准。 1.2.3 竹叶黄酮的骨髓微核实验［9］取健康小鼠，腹腔注射随机分成 5 组，腹腔注射每组动物 10 只，腹腔注射按 急性实验所用腹腔注射最高剂量〔10.00g·（kg·bw）-1〕的 1/2，腹腔注射1/4 和 1/8 设 3 个剂量组，腹腔注射 另设阳性对照组〔环磷酰胺 40mg·（kg·bw）-1〕和阴性对照组共 5 组，腹腔注射连续腹腔注射给药 2d，腹腔注射1 次/d。第 2 次给予受试物后 6h，腹腔注射颈椎脱臼处死小鼠，腹腔注射取胸骨，腹腔注射用止血钳挤出骨髓液 与玻片一端的小牛血清混匀，腹腔注射常规涂片。涂片自然干燥后放入甲醇中固定 5～10min，腹腔注射再放 入 Giemsa 应用液中，腹腔注射染色 10～15min，腹腔注射立即用 pH6.8 的磷酸盐缓冲液冲洗晾干，腹腔注射写好标 签，腹腔注射置干燥器中保存。选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域，腹腔注射在油镜下观察，腹腔注射以有 核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准，腹腔注射观察嗜多染红细胞的微核（呈灰蓝色），腹腔注射而成 熟红细胞呈粉红色。每只动物计数 1000 个嗜多染红细胞，腹腔注射观察含有微核的嗜多染红细胞 数，腹腔注射计算微核率： 微核率（‰）=含微核细胞数观察细胞数×1000 1.2.4 竹叶黄酮的小鼠精子畸形实验［6,7,9］取健康小鼠，腹腔注射随机分成 5 组，腹腔注射每组动物 10 只，腹腔注射按急性实验所用腹腔注射最高剂量〔10.00g·（kg·bw）-1〕的 1/2，腹腔注射1/4 和 1/8 设 3 个剂量组，腹腔注射另设阳性对照组〔环磷酰胺 40mg·（kg·bw）-1〕和阴性对照组共 5 组，腹腔注射连续腹 腔注射给药 5d，腹腔注射于第 1 次腹腔注射给药后的第 35 天用颈椎脱臼处死小鼠，腹腔注射取出两侧副睾，腹腔注射 放入盛有适量生理盐水（1ml）的小烧杯中。用眼科剪将副睾纵向剪 1～2 刀，腹腔注射静置 3～ 5min，腹腔注射轻轻摇动，腹腔注射用 4 层擦镜纸过滤，腹腔注射吸滤液涂片。于空气中干燥后，腹腔注射用甲醇固定 8min，腹腔注射 干燥后用 1%～2%伊红染色 1h，腹腔注射用水轻冲，腹腔注射干燥。在低倍镜下（用绿色滤光片）找到清晰、 精子重叠少的部位，腹腔注射用高倍镜顺序检查精子形态，腹腔注射计数结构完整的精子，腹腔注射每只动物至少检 查 1000 个精子，腹腔注射观察畸形精子数，腹腔注射计算精子畸形率： 精子畸形率（%）=畸形精子数观察的精子数×100 1.2.5 数据处理采用 SPSS 统计软件进行 t 检验和方差分析，腹腔注射并以 LDS 法进行组间的两 两比较，腹腔注射检验的显著性水平设定为 P<0.05(显著水平)和 P<0.01(极显著水平)。 2 结果与分析 2.1 竹叶黄酮的经口、腹腔注射急性毒性（LD50）实验结果见表 1～2。表 1 经口給药 后小鼠毒性反应情况（略）表 2 竹叶黄酮的经口急性毒性（略） 从表 1～2 的实验数据可以看出：竹叶总黄酮经口 LD50 实验，腹腔注射小鼠的饮食、行动、皮 毛、大便等均正常，腹腔注射未发现异常现象，腹腔注射无小鼠死亡，腹腔注射测不出其 LD50。推测其 LD50>21.50g/kg·bw，腹腔注射属实际无毒。 从表 3 和表 4 可以看出：竹叶总黄酮经腹腔注射 LD50 实验，腹腔注射小鼠的饮食、行动、皮 毛、大便等均正常，腹腔注射未发现异常现象，腹腔注射无小鼠死亡，腹腔注射测不出其 LD50。推测其 LD50>10.00g·（kg·bw）-1，腹腔注射属实际无毒。表 3 腹腔注射給药后小鼠毒性反应情况（略） 表 4 竹叶黄酮的经腹腔注射急性毒性（略） 2.2 竹叶黄酮的鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体实验（Ames 实验）结果见表 5～6。 表 5 竹叶黄酮对 TA98 和 TA100 的致突变作用（略）表 6 竹叶黄酮对 TA97 和 TA102 的致 突变作用（略） 由表 5～6 可知，腹腔注射麻竹叶黄酮的 6 个测试浓度在加 S9 或不加 S9 活化的情况下，腹腔注射4 个菌 株 TA97，腹腔注射TA98，腹腔注射TA100 和 TA102 的回变菌落数均与阴性对照组很接近，腹腔注射没有显著性差异 （P>0.05）且没有超过阴性对照组的 2 倍,而与阳性对照组比较要低得多,有极显著性差异 (P>0.01)，腹腔注射因此竹叶黄酮不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突 变的现象。 2.3 竹叶黄酮的骨髓微核实验竹叶黄酮的骨髓微核实验结果见表 7。表 7 竹叶黄酮的骨 髓微核实验结果（略） 由表 7 可知,阳性对照组(环磷酰胺)具有微核嗜多染色红细胞数与阴性对照组(竹叶黄酮 0.00g/kg)相比,差异极显著(P<0.01)。竹叶黄酮的各剂量组小鼠具有微核嗜多染红细胞率与 阴性对照组相比，腹腔注射微核率值非常接近，腹腔注射无明显差异（P>0.05），腹腔注射且无剂量-效量关系，腹腔注射因此 竹叶黄酮没有对小鼠骨髓细胞染色体的断裂效应及纺锤体毒效应。 2.4 竹叶黄酮的小鼠精子畸形实验结果见表 8。表 8 竹叶黄酮的小鼠精子畸形实验结果 （略） 由表 8 可知,阳性对照组(环磷酰胺)具有小鼠精子畸形率与阴性对照组(竹叶黄酮 0.00g/ kg)相比,差异极显著(P<0.01)。竹叶黄酮的各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组相比，腹腔注射小 鼠精子畸形率非常接近，腹腔注射均无显著差异（P>0.05），腹腔注射且无剂量-效量关系，腹腔注射揭示竹叶黄酮对 小鼠精子的畸形无影响。 3 结论 通过实验结果可得出如下结论：小鼠经口 LD50>25g·（kg·bw）-1，腹腔注射腹腔注射 LD50>10g·（kg·bw）-1，腹腔注射属实际无毒；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变 株和碱基置换突变株发生回复突变；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变没有对小鼠骨髓细胞染色体的断裂效应及纺锤体毒效 应；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变也对小鼠精子的畸形无影响。 【摘要】目的观察鼠妇水煎物的镇痛作用。方法通过小鼠扭体法致痛、热板法致痛、 大鼠甩尾法热刺激致痛实验对鼠妇水煎物进行镇痛活性研究。结果鼠妇水煎物（蛋白含 量）90，腹腔注射180，腹腔注射360mg·kg-1 灌胃（ig）对醋酸引起的小鼠扭体反应有明显的抑制作用，腹腔注射抑 制率为 32.00%～58.15%；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变灌胃给药后 30min 和 45min 明显提高小鼠热板痛阈（P＜ 0.01，腹腔注射P＜0.05），腹腔注射镇痛效果随给药量的增加呈剂量依赖关系。结论鼠妇水煎物对多种疼 痛模型均具有明显的抑制作用并呈剂量依赖关系。 【关键词】鼠妇镇痛水煎物 ResearchontheAnalgesicEffectsofWaterDecoctionofArmadillidiunmvulgareinMice Abstract： ObjectiveTostudytheanalgesiceffectsofwaterdecoctionofArmadillidiumvulgareinmice.Meth odsTheanalgesiceffectsofwaterdecoctionfromArmadillidiumvulgareinmicewerestudiedinmi ceandratsusingwrithingreaction,hotplatenociceptivetestandtailflicktest.ResultsTheanalgeplatenociceptivetestandtailflicktest.ResultsTheanalge sicexperimentshowedthatproteinofwaterdecoctionfromArmadillidiumvulgreatthedoseof90, 180,360mg·kg-1hadsignificantinhibitiontowrithingresponse(P＜0.01,P＜ 0.05)inducedbyaceticacid.Theinhibitoryratewasfrom32.00%to58.15%.ThepainthresholdinmicewiththehotplateprocedureincreasedobviouslyafterbeingtakenwaterdecoctionfromArmadillidiumvulgar efor30minand45min(P＜0.01,P＜ 0.05).Thethreegroupswithdifferentdoasgescouldobviouslyincreasethepainthresholdinimce .Thepainthresholdinratsprocedureincreasedobviouslyafterbeingtakenwaterdecoctionfrom Armadillidiumvulgarefor60minand90mininthetailflicktest(P＜0.01,P＜ 0.05).Thethreegroupswithdifferentdosagescouldobviouslyincreasethepainthreshold.Concl usionThewaterdecoctionfromArmadillidiumvulgarehassignificantanalgesiceffectonanimal modelsandshowsobviouslydoseplatenociceptivetestandtailflicktest.ResultsTheanalgeeffectralationship. Keywords：Armadillidiamvulgare;Antalgesia;Waterdecoction 鼠妇为鼠妇科动物平甲虫 Armadillidiamvulgave 的干燥全体［1］，腹腔注射分布在广东、河北、 山东、江苏、浙江等地。主要含多糖、蛋白质、蚁酸，腹腔注射具有解毒止痛、破血利水作用。国 内曾有报道［1］，腹腔注射将鼠妇煎煮用于肝癌晚期的止痛，腹腔注射作用持久性优于杜冷丁，腹腔注射民间有用 于治疗手术后疼痛。有文献报道［2］，腹腔注射鼠妇中蛋白起镇痛作用。为此，腹腔注射本文以鼠妇水煎 物的蛋白含量为指标，腹腔注射采用两种动物三种镇痛模型对鼠妇水煎物镇痛作用进行研究，腹腔注射为进 一步开发鼠妇及临床用药提供实验理论依据。 1 材料与方法 1.1 药物鼠妇干体，腹腔注射购于长春中医学院，腹腔注射并由长春中医学院鉴定。焙干鼠妇，腹腔注射经粉碎 后用水煎煮 3～4h，腹腔注射过滤，腹腔注射8000r/min 离心取得上清液即为鼠妇水煎物，腹腔注射采用 Folin 酚法测 定蛋白浓度。 1.2 试剂盐酸曲马多 50mg/片，腹腔注射由石药集团欧意药业有限公司生产，腹腔注射批号： H1096106。生理盐水由内蒙古康源药业提供，腹腔注射批号：030819。冰醋酸由北京北化精细化 学品有限责任公司提供。 1.3 实验动物 18～22g 清洁级昆明小鼠，腹腔注射雌雄各半，腹腔注射由吉林大学生物实验中心提供。 清洁级 Wistar 大鼠，腹腔注射体重 180～200g，腹腔注射雌雄各半，腹腔注射由吉林大学生物实验中心提供。 1.4 实验仪器安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变智能热板仪（YLSplatenociceptivetestandtailflicktest.ResultsTheanalge6B），腹腔注射 （HH）恒温水浴锅，腹腔注射江苏中大仪器厂。 1.5 统计学处理实验数据以±ss 表示，腹腔注射组间组内比较采用 t 检验。 1.6 方法 1.6.1 醋酸诱发小鼠扭体镇痛实验［3，腹腔注射4］ 取禁食 12h 小鼠 50 只（雌雄各半）随机分成 5 组，腹腔注射第 1 组灌胃（ig）生理盐水，腹腔注射为阴 性对照组；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变第 2 组灌胃（ig）盐酸曲马多 15mg/kg，腹腔注射为阳性对照组；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变第 3～5 组分别灌胃不 同剂量的鼠妇水煎物受试液组（蛋白含量分别为 90，腹腔注射180，腹腔注射360mg·kg-1）3 个剂量。各组 给药 30min 后，腹腔注射分别每只鼠腹腔注射（ip）0.6%醋酸溶液 0.1ml/10g，腹腔注射观察 20min 内各鼠 有无扭体反应出现及产生的扭体反应数并计算扭体次数减少百分率（%）。整个实验温控 于（21±s1）℃。 扭体次数减少百分率（%）=对照组扭体反应均数-试药组扭体反应均数试药组扭体反 应均数×100% 1.6.2 小鼠热板法［5］ 将 50 只雌性小鼠（初筛，腹腔注射5s＜痛阈＜30s）随机均分 5 组，腹腔注射每组 10 只。第 1 组灌胃 （ig）生理盐水，腹腔注射为阴性对照组；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变第 2 组灌胃（ig）盐酸曲马多 1.5mg/kg，腹腔注射为阳性对照组；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变 第 3～5 组分别灌胃不同剂量的鼠妇水煎物受试液（蛋白含量分别为 90，腹腔注射180，腹腔注射360mg·kg1）3 个剂量。灌胃后 15，腹腔注射30，腹腔注射45 及 60min 记录小鼠投入热板至出现舔后足的反应时间 （s）作为痛阈值。如小鼠在热板上停留 60s 后仍无痛反应，腹腔注射应立即取出，腹腔注射按 60s 计算。痛 阈提高百分率（%）为： 痛阈提高值（%）=用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值用药前平均痛阈值×100% 1.6.3 大鼠甩尾法［6］ 以（55±s1）℃恒温水浴为热致痛源。取 Wistar 大鼠固定后，腹腔注射将其尾尖部以上 5cm 放 入热水中，腹腔注射记录大鼠尾部入水到缩离水面的时间，腹腔注射间隔 5min 测两次，腹腔注射挑选甩尾反应平均 时间在 3～10s 以内的大鼠 50 只，腹腔注射雌雄各半，腹腔注射随机分为 5 组，腹腔注射第 1 组灌胃（ig）生理盐水，腹腔注射 为阴性对照组；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变第 2 组灌胃（ig）盐酸曲马多 1mg/ml，腹腔注射为阳性对照组；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变第 3～5 组分别灌 胃不同剂量的鼠妇水煎物受试液组（蛋白含量为 90，腹腔注射180，腹腔注射360mg·kg-1）3 个剂量。于给 药后 30，腹腔注射60，腹腔注射90，腹腔注射120，腹腔注射150min 分别测定大鼠的甩尾时间，腹腔注射痛阈提高百分率（%）。 2 结果 从表 1 可见，腹腔注射与对照组相比，腹腔注射在醋酸诱发小鼠扭体镇痛实验中，腹腔注射盐酸曲马多和鼠妇水 煎物 3 个剂量组对醋酸诱发小鼠扭体反应均有明显的抑制作用（P＜0.01），腹腔注射鼠妇水煎物 的低、中、高 3 剂量扭体减少百分率分别为 32.00%，腹腔注射48.15%，腹腔注射58.51%。镇痛效果随给药 量的增加呈剂量依赖关系。表 1 鼠妇水煎物对醋酸诱发小鼠扭体反应的影响(略) 在小鼠热板实验里，腹腔注射盐酸曲马多和鼠妇水煎物均能延长小鼠热板痛阈反应时间（P＜ 0.05 或 P＜0.01）。鼠妇水煎物在 ig 后 15min 发挥药效，腹腔注射30min 左右药效达到最大。鼠妇 水煎物低、中、高剂量镇痛效果随给药量的增加呈剂量依赖关系。结果见表 2。表 2 鼠妇 水煎物对小鼠热板热刺激实验影响(略) 在大鼠甩尾热刺激法中，腹腔注射鼠妇水煎物低、中、高剂量组均能明显提高大鼠甩尾热刺激 的痛阈，腹腔注射与给药前基础痛阈值及对照组比较均有显著性差异（P＜0.05 或 P＜0.01），腹腔注射而 且鼠妇水煎物低、中、高 3 个剂量镇痛效果随给药量的增加呈剂量依赖关系，腹腔注射见表 3。由 此可见，腹腔注射鼠妇水煎物具有镇痛作用。表 3 鼠妇水煎物对大鼠热刺激甩尾实验影响(±ss) 3 讨论