凉燥致病机制探究论文

【摘要】目的研究凉燥对小鼠的主要致病机制。方法 216 只无特定病原体级（SPF） 昆明小鼠随机分为常温常湿组（A 组），常温燥组（B 组），凉燥组（C 组），每组 72 只。 在模拟凉燥条件下造模，第 7 天与第 14 天检测气道与皮肤组织病理、气管纤毛运动、气道 液分泌（RS）与气道液 IgG 抗体（IgGRR）、血液流变学、细菌攻击实验与气管细胞 bcl-2 基因、bax 基因表达。结果与 A 组相比，C 组第 14 天气管、肺与皮肤病变明显，肺细菌数 增高，IgGRR 增高，第 7 天 RS 降低（P<0.01），血液流变学影响不明显，但气管细胞 bcl-2 基因表达下降。结论凉燥伤肺、伤津，致气道“纤毛-黏液毯”局部御邪屏障受损；肺津”局部御邪屏障受损；肺津 凝滞于肺，以致宣输失司则皮肤失养。本结果为凉燥致病提供实验资料。 【关键词】凉燥致病机制 Abstract：ObjectiveToinvestigatethepathogeniceffectsofCoolDryonmice.Methods216Kunmingmice(SPF)weredividedintothreegroupsincludinggroupA( normalmice),groupB(normaltemperatureandOuterRDrymice),groupC(CoolDrymice),72mice/ group.RespiratorysecretionofMucopolysacchride(RS),IgGofRespiratory(IgG RR) ，hemorrh eology，BacterialattackingandExpressionofbclR2 ，baxgeneweretestedinday7and14.Res ultsIngroupCthepathologrealchangesofrespiratoryandskinswereobvious,andbacilliaquantit yoflungincreased,bclR2geneexpressionwasreducedsignificantlycomparedwithgroupA(P<0. 01).ConclusionIthasfirstprovidedtheevidencesofCoolRDrythatinjuredthewindpipeandskinsa ndthedefencedof“lanketofCilla-mucus”andreducedtheexpressionofbcl2gene,whichwasrelatedtothemechanismsofCoolRDry. Keywords：Cool-Dry;Pathogenicmechanism 燥气清冷肃降，肃杀收引，“燥气先伤于华盖”，易伤津液。“秋深初凉，西风肃杀，感”，易伤津液。“秋深初凉，西风肃杀，感 之者，多病风燥，此属燥凉，较严冬风寒为轻。”外燥有温燥与凉燥之分，但未见凉燥病机 系统性实验研究报道。在相关研究中证实外燥致小鼠气道病变的基础上［1］，本文研究 凉燥及相兼细菌攻击对小鼠气管纤毛运动、气道液分泌与气道液 IgG 抗体、血液流变学及 气管细胞 bclR2 基因，bax 基因表达等影响，为阐析凉燥致病机制提供资料。 1 材料与方法 1.1 动物 无特定病原体级（SPF）昆明种小鼠 216 只，体重（18±1）g，雌雄各半，湖北省实 验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2003-2005。 1.2 仪器与试剂 LRH250R250 人工智能气候箱（温度：（30～65±1）℃，相对湿度：（30～90）% ±5%，广东医疗器械厂），XSJDRD 恒温倒置显微镜（重庆显微镜厂），CS501 超级恒温器 （重庆实验仪器厂），756MC 紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），FASCOR 全自动血液流变仪（重庆南方医疗设备公司）。咔唑（批号：054K078，Sigma 公司）， D-葡萄糖醛酸内酯（批号：2711EC，Sigma 公司），四硼酸钠与台氏液试剂、10%甲醛、 H250E 染料（分析纯，批号：050108）上海精细化工科技有限公司。TUNEL 试剂盒 （MK1020，2005R03）、bclR2 兔抗鼠 IgG 多抗（BA0412，2005R03）、bax 兔抗鼠 IgG 多抗（BA0315，2005R03）和阳性对照片由武汉博士德生物工程有限公司提供。 1.3 菌株 金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC25923，北京天坛生物制品公司)。 1.4 方法 1.4.1 动物模型及分组 216 只昆明小鼠随机分为常温常湿组、常温燥组、凉燥组，每组 72 只，分批置人工气 候箱内、用昆明种小鼠饲料常规饲养。按表 1 模拟外燥“温度R相对湿度R风”条件进行造模。 各组第 7 天和第 14 天进行检测前 4h 禁食、禁水。表 1 各组小鼠“温度－相对湿度－风”处 理条件（略） 1.4.2 病理组织学观察 断颈处死小鼠，常规取气管 1.5cm，右肺组织（中）（40±10）mg/只、背部皮肤 （0.5cm×0.5cm）及左足垫皮肤，H250E 染色、镜检。 1.4.3 气管上皮纤毛运动实验（CiliamovementofTrachealEpithelium,CM,min/mm）： 按文献方法［2］。 1.4.4 气道液黏多糖（RespiratorysecretionofMucopolysacchride,RS,μg/mlg/ml）测定：咔 唑比色法，参考文献方法［2］。 1.4.5 气道液 IgG（IgG-R）检测 常规气管插管，取灌洗液分离上清，按酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒说明书检 测。以包被液作空白对照，PBSpH2507.4（10%小牛血清）作阴性对照。每份样品检测 3 次， 记录标本均值与阴性对照（P/N）倍数之平均值。 1.4.6 血液流变学检测［3］ 受血液流变仪对血量标本的限制，每组取 9 只小鼠眼球血合为 1 份标本进行测试，3 份/组。肝素抗凝管取眼球血，4h 内测定血浆黏度、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数。 1.4.7 细菌攻击实验 取培养 18h 金黄色葡萄球菌，经标准比浊法配成细菌悬液（1×108cfu/ml），各组小鼠 于第 7 天经鼻常规滴种金黄色葡萄球菌 0.1ml/只，24h 后重复 1 次。接种细菌第 6 天无菌 取小鼠右肺（40±10）mg/只常规检测肺细菌数（BacilliaQuantity,BQ，1×106cfu/g 取均 值），以及 RS 与 IgGRR［4］。 1.4.8 气管细胞凋亡检测 第 14 天取气管切片，按脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL） 试剂盒程序操作。结果判断：气管上皮细胞核内出现棕黄色颗粒为 TUNEL 染色阳性。镜 下随机计数 200 个细胞，计算： 细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数 200×100% 1.4.9 气管细胞 bcl-2 基因，bax 基因表达检测第 14 天常规取气管标本切片、按试剂盒 说明书操作。结果判断：气管上皮细胞浆内出现棕黄色颗粒为 bcl-2（或 bax）表达阳性。 镜下计数 500 个细胞，计算： 阳性指数（PI）=阳性细胞数记数细胞数×100% 1.4.10 统计学处理 实验数据以±s 表示，采用 SPSS13.0 软件，资料之间比较用 ANOVA 分析，显着性检 验采用多个样本均数间 q 检验（Newman-Keuls 法）；各组第 7 天与第 14 天比较用 t 检验， P<0.05 认为差异有统计学意义，检验水准为双侧 α=0.05。 2 结果 2.1 气管、肺结构观察常温常湿组第 7、第 14 天气管上皮结构完整、纤毛整齐，气管 腺体、细支气管与肺泡未见异常，背部皮肤结构完整，毛球数多，新生毛干数丰富且层次 清晰，足垫皮肤汗腺丰富。常温燥组第 14 天部分气管纤毛倒伏、黏连，肺泡轻度淤血，皮 肤未见异常；凉燥组第 14 天气管上皮鳞状化生，气管纤毛多呈灶状缺损，≤20%气管浆液 腺上皮黏液腺化生，肺部淤血、水肿明显，均较第 7 天严重；背部皮肤无明显异常，但足 垫部皮肤腺体明显减少与皮下结缔组织增生。 2.2 凉燥对气管上皮纤毛运动（CM）、气道液黏多糖（RS）与 IgGRR 的影响结果见 表 2。表 2 凉燥对小鼠气管纤毛运动、气道液黏多糖与 IgG-R 的影响(略) 2.3 凉燥对小鼠血液流变学的影响见表 3。与常温常湿组比较，凉燥组血液流变学指标 改变无显著性。表 3 凉燥对小鼠血液黏度的影响(略) 2.4 凉燥相兼细菌攻击对小鼠肺细菌数（BQ）、呼吸道液黏多糖（RS）与 IgG-R 的影 响见表 4。表 4 细菌攻击对凉燥小鼠 BQ、RS 与 IgG-R 的影响（略） 2.5 凉燥对气管细胞凋亡与 bcl-2 基因、bax 基因表达的影响见表 5。表 5 凉燥对小鼠 气管上皮细胞 bcl-2、bax 基因表达与细胞凋亡的影响(略) 3 讨论 按表 1 条件处理，病理检查可见凉燥组第 14 天气管上皮鳞状化生与炎性细胞浸润，气 管纤毛多呈灶状缺损，肺泡充血、水肿明显，表明凉燥伤肺、伤津，肺失其濡养而致组织 细胞结构受损；≤20%气管浆液腺上皮黏液腺化生，提示与凉燥肺津生成障碍相关；足垫皮 肤汗腺明显减少与结缔组织增生等，表明肺宣输失司、皮毛腠理失之濡润，合以卫表不固， 致“燥气先伤于华盖”，易伤津液。“秋深初凉，西风肃杀，感”。本结果为凉燥致病提供组织学证据。 气道液内含黏蛋白（主为黏多糖和蛋白质），覆盖”，易伤津液。“秋深初凉，西风肃杀，感于黏膜表面形成黏液毯”局部御邪屏障受损；肺津，是气道的 重要保护性屏障之一；RS 与气道液分泌呈正相关，其主要作用是湿润气道黏膜、保护上 皮的纤毛运动。与常温常湿组比较，凉燥组第 7 天 RS 减少，显示凉燥早期气道液分泌严 重减少而具“干”之特点。值得注意的是凉燥组第“干”之特点。值得注意的是凉燥组第 14 天 RS 明显增多（P<0.01），其机理可 能是凉燥之邪的凉气可伤肺阳而致肺津不化、凝聚成痰饮，故气道液明显增加。气道纤毛 受“凉凝”之气道液刺激而病理性运动加快。凉燥组细菌攻击后 RS 明显减少，也提示生物病 原攻击可加重气道分泌障碍与“正气”受损［5］。IgG-R 是气道重要免疫防御成分之一，凉 燥组第 7～14 天以及细菌攻击后 RS 增高，与机体的保护性反应有关。凉燥相兼细菌攻击， 外则卫滞邪郁，内则津少气虚，抗邪无力则病邪入里；肺津不化则凝成痰饮，细菌及其毒 素可加重肺津生成障碍与宣输失司更甚，加之气道局部御邪屏障受损则对生物病原攻击的 敏感性增高，但故凉燥组肺细菌数是常温常湿组的 7.1 倍，结果提示凉燥病机之一与损伤 气道分泌与“纤毛-黏液毯”局部御邪屏障受损；肺津”有关。凉燥组血液黏度变化不明显，但红细胞刚性指数增高，提 示血液运行障碍，其机理有待研究。 bcl-2 属于低丰度表达基因，编码的 bcl-2/bax 家族蛋白如 bcl-2/bax 二聚体为抑制细胞 凋亡构型，bax/bax 二聚体可诱导细胞凋亡。结果显示，常温常湿组与凉燥组气管细胞凋 亡率均较低（≤0.3%），但凉燥组气管 bcl-2 阳性细胞多见于气管纤毛缺损或鳞状上皮化生 处，提示与凉燥致病机制相关。 结果表明，凉燥主要病机可能是：凉燥伤津，凉燥之邪的凉气可伤肺阳而致肺津不化， 凝集成痰饮，合以宣输失司，皮毛腠理失养而致卫表不固；肺津生成锐减，气道“纤毛-黏 液毯”局部御邪屏障受损；肺津”生物防御屏障受损，合以对生物病原攻击敏感性增加等综合因素致病。凉燥致气管细 胞 bcl-2 基因表达下调与凉燥致病机制的相关性值得研究。