乙肝病毒药物研究论文

【摘要】乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)hepatitisBvirus,HBV))感染已成为危害人类健康的重要疾病。目 前,临床上抗 HBV) 药物主要以干扰素、核苷类似物、免疫调节药物为主,此外,中草药及其有 效成分抗 HBV) 治疗也占有重要的地位。本文对抗 HBV) 的药物作用机制、研究、应用情况 做一综述,以便明确其发展趋势及今后的研究方向,从而推动新型高效药物的研发。 【关键词】乙型肝炎病毒;抗病毒药物;干扰素;核苷类似物;中草药 世界卫生组织估计全世界大约有 20 亿乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)hepatitisBvirus,HBV))感染者,其中 3.5~4 亿为 HBV) 慢性感染者,每年由于急慢性 HBV) 感染而死亡的人数达到 100 万,并呈上升 趋势。而我国是乙肝大国,占据其中的 1/3,有 1.2 亿 HBV) 携带者。从数据而知,乙肝病毒感 染已成为危害人类健康的重要疾病,因此对 HBV) 感染者有效的抗 HBV) 治疗在全世界特别是 在我国显得尤为迫切。 国内外在治疗 HBV) 感染研究中,认为 HBV) 的持续感染是造成乙肝慢性化的主要原因,且 可导致病情发展、恶化至肝硬化、HBV) 相关性肝细胞癌。因此,抗病毒治疗是慢性乙肝治疗 的关键,被认为是迄今为止治疗 HBV) 感染最基本的病因治疗,以抑制肝炎病毒复制为依据。 本文就抗 HBV) 药物的研究进展做一综述。 1 干扰素(hepatitisBvirus,HBV)interferon,IFN)) IFN) 是机体感染病毒时,宿主细胞通过抗病毒应答产生的一组结构类似、功能相近的低 分子糖蛋白,是抗病毒感染最重要的一种细胞因子[1]。主要分为 α、β 和 γ 三型,其中 IFN)-αα 和 β 具有直接抗病毒作用。自 1992 年 IFN)-αα2b 被批准用于治疗病毒性肝炎以来,迄今为止 仍是被 FDA 批准的首先药物。目前全球获准上市的 IFN) 有 12 个,以 IFN)-αα 居多,其临床疗效 无明显差异。IFN) 的抗病毒机制包括免疫调节作用和直接抗病毒作用,并以前者为主[2]。近 年发现,IFN) 在还有抗肝纤维化的作用。目前,IFN)-αα 在抗 HBV) 治疗中的问题是效果有限,抑 制病毒复制但难以清除病毒,而且停药后有复发现象。近年来国内外均倾向于采用重组干扰 素,激素撤除合并干扰素疗法以及干扰素与其他抗病毒药物结合疗法治疗 HBV) 感染。如聚 乙二醇 IFN)-αα[3]是聚乙二醇(hepatitisBvirus,HBV)PEG))与重组 IFN) 仅结合形成的长效干扰素。 2 核苷类似物(hepatitisBvirus,HBV)nucleosideanalogue) HBV) 为双股 DN)A 病毒,其复制需经过逆转录过程,该类药物可抑制 HBV)-αDN)A 逆转录酶 活性,从而达到破坏病毒的作用。 2.1 拉米夫定(hepatitisBvirus,HBV)lamivudine,LMV))是一种嘧啶核苷类抗病毒药,作为酶底物 dCTP 竞争性 抑制剂,通过抑制病毒逆转录酶及 DN)A 多聚酶,终止病毒 DN)A 链延长,故可使 HBV)-αDN)A 很 快减少。清除 HBe 和促进 HBeAg/抗 HBe 的血清转换,减少血液和肝脏内的病毒载量。 SchmilovitzWeiss 等[4]的临床研究表明,给急性重型肝炎患者口服 LMV) 后,能有效、迅速地 抑制 HBV)-αDN)A 的复制,使患者获得病毒学、肝组织学和肝脏生化功能的改善,且患者耐受性 好,无明显不良反应。但长期用 LMV) 易导致的 HBV) 突变株而降低疗效,且价格较贵,口服吸 收率低,停药后极易产生“反跳”现象”现象,且 YMDD 的存在影响肝病理的改善。 2.2 阿德福韦(hepatitisBvirus,HBV)adefovir,ADV))是为无环腺嘌呤核苷单磷酸,可绕过第一步磷酸化,后者常 常是核苷类药物在细胞内转化的关键步骤并影响药效。它不需要转化成三磷酸形式,只要二 磷酸形式就能抑制 HBV)-αDN)A 聚合酶与逆转录酶。体内外研究表明,ADV) 可明显抑制 HBV) 野生型和 LMV) 诱导病毒变异株的复制。对由 LMV) 耐药病毒株引起的急性或亚急性重型肝 炎,较早加用 ADV),能减缓或终止病情恶化,降低病死率[5]。目前尚未发现有对 ADV) 耐药的 病毒株,故其有望成为治疗对其他核苷类似物耐药病毒株的有效药物。 2.3 其他恩替卡韦(hepatitisBvirus,HBV)entecavir,ETV))、替比夫定(hepatitisBvirus,HBV)Telbivudine,LdT)已经批准上市,其他一 些核苷类抗病毒药物如克拉夫定(hepatitisBvirus,HBV)clevudine)Ⅰ 期临床研究已经完成。恩曲他滨 (hepatitisBvirus,HBV)emtricitabine,FTC)和替诺福韦(hepatitisBvirus,HBV)tenofovir)正在Ⅲ期临床研究中。另外期临床研究中。另外,如利巴韦林(hepatitisBvirus,HBV)病毒 唑,ribavirin)、阿糖腺苷及其单磷酸盐、阿昔洛韦(hepatitisBvirus,HBV)无环鸟苷,acyclovir)、膦甲酸酯 (hepatitisBvirus,HBV)phosphonoformate,foscarnet,PFA)、聚肌胞(hepatitisBvirus,HBV)双链多聚核苷酸,Poly:C)等也是直接或间接作 用于病毒 DN)A-αP 的广谱抗病毒药,在慢性病毒性肝炎的治疗上也取得了一定的疗效,但也具 有易复发等缺点。同时,很多新的核苷类抗病毒药物正在进行抗 HBV) 的评估,继续研究设计 新的核苷类似物也可防备耐药突变株的出现[6]。无论如何,这类药物为抗 HBV) 的研究提供 了新的希望。 3 中草药及其有效成分 许多具有抗 HBV) 的中草药被发现,受到国内国外的高度关注和广泛研究。总的来说,中 草药一般同时具有多种活性:能减轻肝损伤症状,丙氨酸转氨酶(hepatitisBvirus,HBV)ALT)活力下降,并能促进肝细 胞再生,使肝组织坏死区迅速修复;或者抑制 HBV)-αDN)A 聚合酶,在 DN)A 水平上阻断病毒的复 制;或者具有 HBsAg 结合活性,阻断病毒颗粒装配成有浸染活性的病毒颗粒。国外学者从大 量中草药中筛选了很多具有抑制 HBV) 表面抗原和 HBV)-αDN)A 聚合酶作用的草药,而且研究 发现具有 HBV)-αDN)A 聚合酶抑制作用的草药还有刺激产生肿瘤坏死因子(hepatitisBvirus,HBV)TN)F)的作用。有人 对 60 种中药的抗 HBV) 作用进行了体外实验研究,发现有 28 种对 HBV)-αDN)A 抑制率达 50% 以上,18 种达 25%~50%,主要为清热解毒药,其中部分可降解 HBV)-αDN)A。 3.1 苦味叶下珠 1982 年印度学者 Thyagajan 等首次报道苦味叶下珠 (hepatitisBvirus,HBV)PhyllanthusamarusL)体外对 HBsAg 有灭活作用[7],叶下珠为大戟科叶下珠属植物叶下珠 PhyllanthusurinaiaL 的干燥全草,具有清热解毒、明目等功效,主要治疗腹泻下痢、尿路感染、 肝炎等[8,9]。刘庄等[10]的研究表明不同叶下珠品种和制剂在体外均有不同程度的抗 HBV) 活性,而未显示明显的细胞毒性,相同剂量下,药物对 HBsAg 和 HBeAg 的抑制较对 HBV)-α DN)A 抑制效果好,提示药物对病毒颗粒产生的抑制不仅在转录前水平,可有对 mRN)A 翻译水 平、蛋白分泌等环节也有影响。 3.2 垂盆草中药垂盆草 SedumsarmentosumBunge 为景天科景天属多年生草本植物,又 名地蜈蚣草、佛甲草,我国分布广泛。它具有清热解毒,抗菌消炎作用[11]。广泛的临床应用 已证明垂盆草及其制剂具有显着的抗肝炎作用。1979 年方圣鼎等分得一水溶性氰苷类成分: 2-α氰基-α4-αO-αβ-αD-α葡萄糖反丁烯-α2-α醇,并指出其为抗肝炎活性成分[12]。诸国华等[13]研究发 现垂盆草甙是抗肝炎的活性成分;其水溶性成分具有调节机体免疫能力的作用[14]。 3.3 水芹水芹(hepatitisBvirus,HBV)OenanlbeJapanica)在临床中对高血压、高脂血症、心脑血管疾病患者 具有防治作用。研究发现,水芹甲醇撮物(hepatitisBvirus,HBV)100mg/kg)可明显降低血浆中脂质过氧化产物丙二 醛的含量,保护超氧化物歧化酶的活性[15]。水芹[16]可以通过减少肝脏脂质过氧化产物生 产是 CC14 所致的肝细胞空泡样变性、线粒体肿胀、粗面内质网扩张等病理损害减轻,抑制 HBV)-αDN)A 的复制,从而达到抗病毒的效果。 3.4 其他有效的抗 HBV) 的中草药很多,还有多糖类如猪苓多糖、香菇多糖、云芝多糖等 等,它们都有一定的抑制 HBV) 复制的作用,并且在治疗中安全,无明显不良反应,但其作用机 制尚待研究。中药汤剂对 HBV) 也有一定作用。但中药治疗目前存在诸多问题,只有将中药 与现代药物研究技术有机结合,采用随机大样本前瞻性对照研究,才能从中寻找和筛选出真正 有效的药物,为人类造福。 4 免疫调节药物 免疫调节剂可以提高人体的免疫功能,尤其是对 HBV) 的特异性免疫,还可以识别和破坏 HBV) 感染的靶细胞,达到清除 HBV) 的目的。但应用免疫调节剂对 HBV)-αDN)A 和 HBeAg 的阴 转率尚未见报道,目前多作为辅助或与其他抗 HBV) 药物联合治疗。 胸腺肽 α1(hepatitisBvirus,HBV)thymosin-αα1,Tα1)是一种人工合成、由 28 个氨基酸组成的高纯度多肽,具有 较强的免疫调节作用,其作用机制可能为增强 T 细胞和 N)K 的应答功能及刺激 IL-α2 和 IFN) 的 产生,增加 IL-α2 受体及组织相容性复合物Ⅰ类抗原在淋巴和非淋巴系细胞的表达类抗原在淋巴和非淋巴系细胞的表达,因而有利 于机体清除肝炎病毒;同时还可以减轻 TN)F-αα 的细胞毒作用,减轻肝细胞的免疫病理损伤,促 进肝脏功能的修复[17]。国外有一项关于 Tα1 治疗慢性乙型肝炎的临床研究中,用 Tα1 治疗 24 周,72 周后 1.6mg 组 HBV)-αDN)A 阴转率 30%(hepatitisBvirus,HBV)bN)DA 法)和 15%(hepatitisBvirus,HBV)转录介导扩增 法,TMA),HBeAg 阴转率达 22.8%;0.8mg 组的效果类似[18]。 其他免疫调节剂还有胸腺因子、左旋咪唑涂布剂、免疫核糖核酸、HBV) 特异性转移因 子等。免疫调节剂在慢性乙型肝炎中的应用目前还缺乏针对性,疗效不确切,尚有待进一步研 究。特异性免疫调节剂,如树突状细胞(hepatitisBvirus,HBV)dendriticcell,DC)疫苗、HBV) 的 S 和前 S2 治疗性疫 苗、CTL 多肽疫苗、DN)A 疫苗、反义核酸等处于实验研究阶段,治疗效果有待进一步研究。 预计这种新疫苗将成为人类战胜感染性疾病的有力武器。 【摘要】目的建立骨血康胶囊中淫羊藿苷含量的测定方法。方法采用高效液相色谱法。 结果骨血康胶囊中淫羊藿苷浓度在 0.04~0.36mg/ml 范围内呈良好的线性关系,平均回收率 为 99.26,RSD 为 1.86%(hepatitisBvirus,HBV)n=6)。结论本方法准确,重现性好,可用于骨血康胶囊中淫羊藿苷的 含量测定。 【关键词】骨血康;淫羊藿苷;HPLC 【Abstract】ObjectiveToestablishamethodfordeterminationoficariininG)uxuekangcaps ules.MethodsHPLCmethodwasused.ResultsThelinearrangesoficariinwas0.04~0.36ug(hepatitisBvirus,HBV)r=0 .9997),andtheaveragerecoverywas99.26%withRSD1.86% (hepatitisBvirus,HBV)n=6).ConclusionThismethodisaccurate,reproducibleandsuitableforthedeterminationoficar iininG)uxuekangcapsules. 【Keywords】G)uxuekangcapsules;icariin;HPLC 骨血康胶囊由淫羊藿、黄芪、当归、熟地、白芍、川芎、甘草等组成,具有补肾益髓、 益气补血的作用。本文报道了采用高效液相色谱法,以淫羊藿苷作为含量检测指标,参照 2005 版《中国药典》及相关文献[1~3〗 1 仪器与试药 1.1 仪器 Waters 高效液相色谱系统。 1.2 试药与试剂淫羊藿苷(hepatitisBvirus,HBV)737-α9404)购于中国药品生物制品检定所;骨血康胶囊(hepatitisBvirus,HBV)制剂组 提取);甲醇为色谱纯,乙腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。 2 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:KromasilC18(hepatitisBvirus,HBV)规格:4.6mm×200mm,5μm);m);流动相:乙腈:水(hepatitisBvirus,HBV)30:70),检测波长为 270nm,柱温为室温,流速 1.0ml/min,进样量 10ul。理论塔板数按淫羊藿苷计算应不低于 2000。 3 含量测定结果 3.1 对照品溶液的制备精密称定淫羊藿苷对照品适量,置于 10ml 量瓶中,加甲醇制成 0.1mg/ml 的溶液,作为对照品溶液。 3.2 供试品溶液的制备精密称定胶囊内容物 1g,置 100ml 具塞锥形瓶中,精密加入 100ml 稀乙醇溶液,密塞,称定重量,超声处理 1h,放冷,用稀乙醇补足减失重量,摇匀,滤过,取续滤液作 为供试品溶液。 3.3 阴性对照溶液制备取处方量,以相同工艺制备不含淫羊藿药材的阴性制剂,依 3.2 项 下方法操作制备阴性对照溶液。 3.4 测定方法分别精密吸取各溶液 10μm);l,注入液相色谱仪,测定峰面积,计算即得。 3.5 专属性试验分别取对照溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各 10μm);l 注入液相色谱仪, 试验结果表明,对照品溶液(hepatitisBvirus,HBV)见图 2)和供试品溶液(hepatitisBvirus,HBV)见图 3)均在相同保留时间内出现色谱峰,而 阴性对照溶液(hepatitisBvirus,HBV)见图 1)在淫羊藿苷主峰位置无吸收峰。 图 1 阴性对照品溶液图 2 对照品溶液图 3 供试品溶液 3.6 线性关系考察精密称取淫羊藿苷适量,置 50ml 量瓶中,用甲醇配制 0.1mg/ml 溶液。 分别精密吸取 1,3,5,7,9ml 于 25ml 量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,分别吸取 10μm);l 注入色谱 仪中测定,以对照品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。回归方程为 Y=32640X+5.8635r=0.9997,由此可见,淫羊藿苷在 0.04~0.36mg/ml 范围内呈良好的线性关 系。 3.7 精密度实验配置对照品溶液,连续 5 次等量注入同台液相色谱仪中,测定峰面积,其 RSD 为 1.33%。结果表明该色谱条件精密度良好。 3.8 重复性试验取同一批样品 5 份,按上述条件测定,结果样品中淫羊藿苷平均含量为 9.20mg/g,RSD=0.68%。 3.9 稳定性试验分别取淫羊藿苷对照品溶液(hepatitisBvirus,HBV)0.0948mg/ml)10μm);l 和样品供试液于 0,2,4,6,8h 进样,测定峰面积。结果对照品 RSD=1.02%,供试品 RSD=1.24%。 3.10 加样回收率测定精密称取已知测定含量的样品 5 份,分别加入一定量的淫羊藿苷对 照品,按制备供试品溶液方法制备供试并依法测定,计算回收率,见表 1 表 1 加样回收率测定 3.11 样品测定分别取本品内容物粉末,精密称定,然后按上述方法制备供试品溶液,分别 精密吸取 10ul,按色谱条件测定,计算淫羊藿苷的含量。结果淫羊藿苷平均含量见表 2。表 2 含量测定结果 4 讨论 淫羊藿是骨血康胶囊中的君药,其主要有效成分为淫羊藿苷,本实验建立了高效液相色谱 法测定制剂中淫羊藿苷含量的方法,方法准确,重现性好,可用于骨血康胶囊中淫羊藿苷的含 量测定。 【摘要】目的探索黄芩的新型提取方法。方法采用紫外分光光度法测定黄芩苷含量,比 较水提法与液-α液连续萃取法对黄芩苷提取率的差别。结果水提法与液-α液连续萃取法对黄 芩苷提取率差异有显着性。结论液-α液连续萃取法是一种新型高效提取方法。 【关键词】黄芩;液-α液连续萃取法 【Abstract】ObjectiveTostudyanewextractionmethodforbaicalininradixscutellariae.M ethodsUltravioletspectrophotometrymethodwasusedtodeterminethecontentofbaicalin.The abstractionrateofbaicalinbywaterextractionwascomparedtothatofliquid-α liquidcontinuousextractionmethod.ResultsTherewasasignificantdifferencebetweenthetwo methods.ConclusionTheliquid-α liquidcontinuousextractionmethodisanewandhighefficiencyseparationmethod. 【Keywords】RadixScutellariae;liquid-αliquidcontinuousextractionmethod 黄芩(hepatitisBvirus,HBV)RadixScutellariaebaicalensis)为唇形科植物黄芩(hepatitisBvirus,HBV)ScutellariabaicalensisG)eorgi) 的干燥根。具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎之功,用于发热烦躁、肺热咳嗽、泻痢热 淋、湿热黄疸、胎动不安、痈肿疮毒等症[1]。主要有效成分是黄酮类:黄芩苷、黄芩苷元、 汉黄芩苷、汉黄芩素等。黄芩根中含有黄芩酶,能够促进黄芩苷和汉黄芩苷水解,生成黄芩黄 素和汉黄芩黄素,黄芩黄素分子中带有三个邻位的酚羟基,性质不稳定,容易被氧化转为醌类 衍生物,质量随之降低[2]。目前黄芩提取方法有水提取酸沉淀法、超声法、超滤法、醇提取 酸沉淀法、微波提取法等,而常用的为水提取酸沉淀法,但水提取存在黄芩有效成分提取不完 全、提取出的杂质较多等缺点,因此本文采用液-α液双向萃取法提取黄芩有效成分[3],并与常 用的水提法进行比较。 1 仪器与试剂 1.1 仪器 PHS-α3C 精密 pH 计(hepatitisBvirus,HBV)上海雷磁仪器厂);旋转蒸发器 RE-α52A(hepatitisBvirus,HBV)上海亚荣生化仪器 厂);SHZ-αⅢ 型循环水真空泵(hepatitisBvirus,HBV)河南省巩义适英峪仪器厂);UV)1700(hepatitisBvirus,HBV)日本岛津);BS2245 电子天 平(hepatitisBvirus,HBV)北京赛多利斯仪器系统有限公司);紫外分析仪;超声清洗仪。 1.2 试药黄芩苷标准品(hepatitisBvirus,HBV)中国生物制品检定所);无水乙醇、磷酸、 N)a2HPO4·12H2O、N)aH2PO4·2H2O、盐酸、醋酸、95%乙醇均为分析纯,黄芩药材经兰 州大学药学院生药研究所马志刚教授鉴定为唇形科植物黄芩(hepatitisBvirus,HBV)ScutellariabaicalensisG)eorgi) 的干燥根,粉碎过 60 目筛;磷酸盐缓冲液自配(hepatitisBvirus,HBV)以磷酸溶液及磷酸氢二钠溶液配制 pH 值为 2、3、4、5、6、7 的磷酸缓冲液)。 2 方法与结果 2.1 黄芩苷标准曲线绘制[4]精密称取干燥至恒重的黄芩苷对照品 10.29mg,加 70%乙醇 超声溶解,定容于 50ml 容量瓶中。精密量取黄芩苷对照品液(hepatitisBvirus,HBV)0.2058mg/ ml)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml 分别置于 25ml 容量瓶中,加入 20ml0.2mol/L 盐酸,再加 70%乙醇至刻度,摇匀。于 276nm 波长处测定吸收度,随行试剂空白。以吸光度 A 为纵坐标, 浓度 C 为横坐标绘制标准曲线。回归方程为:Y=0.0551X-α0.0021,R2=0.9993(hepatitisBvirus,HBV)n=6),黄芩苷 在 4.116~24.696mg/L 范围内具有良好的线性关系。见图 1。 2.2 提取方法