【医药学论文】力学刺激对大鼠髁突软骨结缔组织生长因子表达的影响

实验一 周期性单轴压力对大鼠髁突软骨细胞结缔组织生长因子表达的影响的研究
　　　目的：通过对髁突软骨细胞加载机械应力（周期性单轴压力）后进行蛋白印迹法检测结缔组织生长因子的蛋白表达水平的变化，探讨结缔组织生长因子在髁突软骨细胞受力后表达的影响，为正畸治疗中髁突软骨受力后的改建提供生物学依据。方法：采用1周龄SD大鼠提取髁突软骨细胞，进行分离、体外培养及免疫组化鉴定。利用四点弯曲细胞力学加载仪对生长良好的第3代髁突软骨细胞进行体外周期性单轴压力加载，力值为2000u strain，分别在髁突软骨细胞加力0h,0.5h,1h,2h后继续培养24h，应用蛋白印迹法检测在不同加力时间CTGF蛋白表达的变化。 结果：在髁突软骨细胞加力0h,0.5h,1h,2h后继续培养24h，测得CTGF蛋白表达随着加载时间的增加为逐渐上升趋势。
结论：周期性单轴压力可以刺激大鼠髁突软骨细胞CTGF表达，有望作为正畸治疗中促进下颌髁突改建的新的生长因子。
实验二 结缔组织生长因子对生长期大鼠前伸下颌后髁突软骨表达变化的研究
目的：功能矫治器导下颌向前后，髁突软骨细胞受应力作用，髁突会发生适应性改建。本实验通过建立导下颌向前的Sprague-Dawley (SD)大鼠的动物模型进行免疫组化实验，观察结缔组织生长因子（CTGF）在髁突软骨中分布的变化，探讨CTGF对前伸下颌后的髁突软骨的影响。
方法：建立SD大鼠动物模型，选取45只5周龄SD 雌性大鼠，体重约100g，随机分为对照组（20只）和实验组（25）只，组内随机平均分为5组 （3、7、14、21 和30 天）。实验组动物24小时佩戴改良可摘式上颌斜面导板矫治器，对照组动物不做处理。在各实验点常规麻醉后行心内灌注，取髁突，获得标记CTGF,观察髁突软骨各层CTGF 的表达变化。运用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件对CTGF的阳性表达量进行半定量分析。数据导入SPP 18.0 统计学软件，进行t 检验和方差分析： ɑ = 0.05, 双侧，P < 0.05 为有统计学差异。结果：对照组和实验组中髁突软骨组织中均有CTGF的表达，主要分布于肥大层和增值层。实验组不同时间点髁突肥大层CTGF的平均光密度值分别高于对照组的平均光密度值（P < 0.05 ) 。与对照组相比，实验组7天后髁突肥大层CTGF的表达逐渐上升，在第14天达到最高，之后CTGF表达回落，但仍高于对照组（P < 0.05 )。实验3天、30天，实验组与对照组相比无统计学差异。结论：CTGF了参与了功能负荷改变所导致的髁突软骨适应性改建活动，后部尤为明显。 关键词：结缔组织生长因子，髁突软骨，导下颌向前，周期性单轴压力 引 言 功能矫形是治疗青少年安氏Ⅱ类1分类错牙合 畸形的重要方法，是通过改变颌面部肌肉环境从而促进牙合发育及颅颌面骨骼生长的治疗方法。在我国南方，以下颌后缩为主要表现的安氏Ⅱ类1分类比较常见，严重影响了口颌系统的功能和颜面部美观。正畸治疗中通过前导下颌，改变髁突周围的生物和物理环境，可以促进髁突软骨内成骨，刺激髁突改建。 髁突软骨的形成和改建过程中受许多因素的调控，其中包括细胞因子的作用，它们参与软骨细胞增殖、分化、成熟、骨化，从而促进或抑制软骨及骨的生长。CTGF是TGF-β 诱导分泌的一种细胞因子，对组织纤维化具有重要作用。同时CTGF也是一种软骨特异性基因表达产物，对软骨的增殖分化具有重要作用。以往的研究中多局限在CTGF在组织纤维化中的作用。目前关于CTGF对在骨和软骨中作用的研究绝大多数仅仅是针对膝关节软骨、股骨头软骨等，而关于髁突软骨的研究则多集中在髁突骨折损伤、骨关节炎方面，对于CTGF在髁突软骨对功能矫治器等机械应力的反应方面未见有报道。 本实验通过建立SD大鼠前伸下颌的功能矫治模型，检测生长期大鼠髁突软骨在功能矫形前伸下颌后CTGF分布的变化；通过对SD大鼠髁突软骨细胞加载不同时间周期性单轴压力后进行蛋白印迹法检测CTGF的蛋白表达水平变化，探讨CTGF在髁突软骨生长改建过程中的作用，为完善功能矫形的分子生物学机理提供实验依据。 机械压应力可引起软骨细胞生长的变化原因可能在于力学信号通过细胞膜受体, 激活不同信号传导通路, 然后作用于各种效应点, 表现出细胞生长代谢、基质合成等方面的变化。此外，机械应力也可能通过细胞膜表面的离子通道来调控软骨细胞的增值和生长分化。有学者[62,63]认为机械应力可以激活软骨细胞表面的压力敏感通道，从而刺激细胞释放Ca2+,促进蛋白磷酸化、并增加生长因子的分泌。压应力在一定范围内增强，可以延长压力敏感离子通道的开放时间，促进软骨细胞的增值。陈琳实验组所做MTT实验证明了生理性间歇性压应力可促进细胞的增殖；流式细胞周期实验结果提示相同强度下不同持续时间的周期性压应力对软骨细胞的增殖有促进作用，其中加力后培养24h可更好的增强软骨细胞的增值活性。故本实验采用加力后24h检测髁突软骨细胞中CTGF蛋白的相对含量。 机械力的刺激对软骨组织的形成，软骨细胞的增殖、分化，粘附和迁移，及细胞外基质合成等起到重要的作用。应力作用于细胞后，细胞外基质中的纤维、蛋白成分发生改变，细胞内外等渗环境发生变化，细胞受力变形，细胞膜的力学感受器感受机械刺激后，将刺激转换为电化学信号传导至细胞内，激活力学信号通路。然后通过细胞骨架复合体-细胞外基质-整合素的相互作用，将力学刺激信号由细胞膜传导至细胞核，继而影响包括DNA、RNA、 及蛋白质等的合成[64]。本课题组陈琳，刘天悦的实验研究证明了机械压应力可以诱导软骨细胞中整合素β1的蛋白表达，并促进NFκB/p65入核表达。因此推测，CTGF可能在受力后通过整合素/NFκB 将力学刺激由细胞膜传导至细胞核，影响DNA、RNA、蛋白质的合成，从而促进软骨细胞增殖，髁突改建。 　　　CTGF在软骨细胞内的具体作用的机制目前尚不是很清楚，目前主要有两种理论：一种理论认为，CTGF可以调控软骨细胞周期的活性，CTGF等通过周期依赖蛋白激酶抑制剂降低细胞内p15、p21、p27的水平，使pRb磷酸化并释放出E2F，E2F上调后可以有效的促进细胞周期由G1晚期进入S期，从而促进了软骨细胞的增殖作用。另一种理论认为，CTGF可以影响软骨细胞信号转导通路，CTGF通过p44/42有丝分裂原蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路诱导软骨细胞增殖，而通过p38有丝分裂原蛋白激酶（p38MAPK）信号通路调控软骨细胞分化。 　　　研究表明[9]，处于生长期体外培养的兔软骨细胞可高水平的表达CTGF，CTGF可以促进软骨细胞DNA合成，缩短细胞周期及细胞倍增时间。CTGF在兔生长期软骨细胞不同阶段内是通过促进胶原、蛋白多糖合成，增强碱性磷酸酶的活性来促进软骨细胞的增值、分化及软骨内成骨的，同时CTGF的高表达也阻滞了软骨细胞去极化，使衰老退变的软骨细胞反分化而其表型接近正常细胞，促进软骨修复。髁突软骨的生物力学-生物化学耦合反应，软骨细胞的增值和分化，及骨形成需要能量代谢，Aya Maeda-Uematsu在最新的实验中[33]通过比较体外分离的野生型和敲除CTGF的大鼠的软骨细胞，结果证明后者的软骨细胞内的ATP、GTP、CTP 和UTP的水平稳定下降，尤其是ATP的水平下降达到了50%以上，软骨细胞的能量代谢完全受损，实验证明了CTGF可能通过促进软骨细胞的能量代谢从而促进了髁突软骨细胞的增殖。 本实验一中在软骨细胞加力2000ｕstrain力后，随着加力时间的增加，CTGF蛋白表达呈增强趋势，结果可能说明随着时间的延长，髁突软骨细胞能量代谢增强，生物力学-生物化学耦合反应活跃，软骨细胞的增殖、分化提高，CTGF参与髁突软骨改建活动增强。 实验二：生长期前伸大鼠下颌后髁突软骨中结缔组织生长因子表达变化的研究 功能矫治器是治疗青少年安氏Ⅱ类1分类错牙合 畸形的重要方法。它通过前导下颌，改变髁突周围的生物物理环境，从而促进髁突软骨内成骨和下颌骨改建，达到矫治II类错牙合的目的。 　　　髁突软骨是颞下颌关节的重要结构，髁突软骨的生长、改建过程中受多种因素的调控，其中包括细胞因子的作用。目前的研究认为，在导下颌向前的过程中，髁突软骨中SOX9、Ⅱ型胶原、PTHrP、TGFβ、Ihh 、Runx2、Ⅹ型胶原、VEGF的表达水平升高[47-50,52-68]。CTGF是TGF-β分泌的一种细胞外基质，是一种软骨特异性基因表达产物，它在促进软骨细胞的增殖、分化以及关节软骨的修复方面发挥重要作用，而关于CTGF在导下颌向前后髁突软骨的改建中的作用尚不明确。因此猜想CTGF对前导生长期的下颌髁突的改建也起一定作用。本实验通过建立前伸SD大鼠下颌的功能矫治动物模型，检测髁突软骨中CTGF表达水平的时空变化，探讨髁突软骨生长分化的生长因子的调控机制，希望为完善功能矫形的分子生物学理论提供实验依据及临床指导。