医药学论文：四甲基偶氮唑盐比色法测定Vero毒素

【摘要】 目的 测定Vero毒素-1对Vero细胞的毒性。方法 用四甲基偶氮唑盐比色法测定Vero毒素-1对Vero细胞的毒性。结果 Vero毒素-1的CD５０为1pg。结论 四甲基偶氮唑盐比色法方法简便，灵敏度高，且没有同位素的污染，是测定Vero毒素-1对Vero细胞毒性的一个简便方法。
【关键词】 Vero毒素-1；四甲基偶氮唑盐；CD５０
An MTT colorimetric assay for measurement of the CD５０ to vero cells of Vero toxin-1
【Abstract】 Objective To determine the CD５０ to Vero cells of Vero toxin-1.Methods MTT colorimetric assay was used.Results The purified Vero toxin-1 showed cytotoxicity to Vero cells and killed about 50% of cells to 1pg . Conclusion MTT colorimetric assay is a suitable method for the determination of the CD５０ to Vero cells of Vero toxin-1.
【Key words】 Vero toxin-1；MTT；CD５０
肠出血性大肠杆菌能引起出血性结肠炎，溶血性尿毒综合征，其主要血清型O１５７：H7于1982年首次在美国被发现，从而引起出血性结肠炎的爆发流行。1996年在日本也发生了O１５７：H7大肠杆菌爆发流行，共有九千多名儿童感染，死亡12例［１～３］，我国也有O１５７：H7的感染病例。肠出血性大肠杆菌的致病作用主要通过细菌对肠道上皮细胞的黏附和产生毒素两个过程，Vero毒素是其中的主要毒力因子。根据免疫原性，毒素又可分为Vero毒素-1和Vero毒素-2两种。Vero毒素-1有A，B两种亚基组成，其中B亚基的分子量为7.7KDa，它与宿主肠壁黏膜细胞的糖脂受体GB３结合，介导A亚基进入细胞，干扰蛋白质的合成［４～７］。
为了检测Vero毒素-1的毒性，需建立一种适用于常规检测的方法。以前测定细胞毒性一般采用３Ｈ-TdR掺入法或肉眼目测法，前者由于使用了同位素，因而不适用于常规检测，后者受实验者个人经验等因素的影响，所以重复性较差。
1983年Mcsmann介绍了用四甲基偶氮唑盐比色法测定细胞毒性，由于其操作简便，不使用同位素等优点，现已逐步用于许多研究工作中［８，９］。本实验室应用四甲基偶氮唑盐比色法测定了Vero毒素-1的CD５０，为检测Vero毒素-1的毒性提供了一种新的方法。
1 材料与方法
1.1 细胞及培养 实验所用细胞为vero细胞(非洲绿猴肾细胞)。细胞在MEM培养液(含10%小牛血清2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)于5%CO2的培养箱中37℃培养。
1.2 四甲基偶氮唑盐溶液 四甲基偶氮唑盐3-(4，5-Dinetyl-2thiazolyi)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolooum bromid溶于pH 7.2的PBS缓冲液中，浓度为50mg/ml，除菌后于4℃避光保存，使用前用含0.5%小牛血清的MEM培养液稀释至5mg/ml。
1.3 Vero毒素-1 由本实验室自制。
1.4 细胞死亡率的测定 Vero细胞培养于96孔细胞培养板中(10４个/孔)，在5%CO2，37℃条件下培养24h后，每孔加入用Eagle's MeM(5%小牛血清)10倍系列稀释的毒素100μl，培养72h后，吸除药液，每孔加入新鲜配制的四甲基偶氮唑盐溶液(99% MeM，0.5%小牛血清，0.5%四甲基偶氮唑盐溶液)37℃温育2h，吸取上清液，每孔加入150μl二甲基亚枫，振荡30min，在酶标仪上测定OD５７０，以不加细胞和培养基，只加四甲基偶氮唑盐溶液和二甲基亚枫的孔为空白孔，以有细胞而不加毒素的孔为对照孔，计算细胞死亡率。细胞死亡率按下式计算：

 

1.5 CD５０的测定 CD５０的测定方法同细胞死亡率的测定，将纯化的毒素连续倍比稀释后，测定每个浓度的死亡率，以引起50%细胞死亡的最小毒素蛋白质含量为CD５０。
2 结果
在细胞培养孔中加入毒素后24h就可以观察到细胞的病变，用倒置显微镜观察，开始时有部分细胞圆缩，然后可见整片的细胞呈网状，继而细胞发生崩解。
用连续稀释毒素，四甲基偶氮唑盐比色法测得CD５０为1pg。