医药学论文：葛根对成骨细胞OPG、RANKL mRNA 表达的影响

【摘要】 目的 本研究用RT-PCR的方法观察葛根中药血清对成骨细胞细胞因子：OPG、RANKL mRNA表达的影响，力求从细胞水平和分子水平对葛根抗骨质疏松的机制进行探讨，为葛根应用于临床防治骨质疏松提供有力的实验依据。方法 将(250±10)g的SD大鼠36只，随机分为两组：对照组灌服生理盐水，中药组灌服2g/ml的葛根10ml/kg·d，1日2次灌胃，连续3天，最后一次灌胃后中药组和对照组分别1h、2h、4h无菌操作股动脉采血，收集血清备用。出生24h内的SD大鼠，无菌取颅盖骨，做成骨细胞培养。第三代成骨细胞 5×104/ml细胞悬液，24h待细胞贴壁后加入实验因素，6天后用异硫氰酸胍一步法提取总RAN，然后用RT-PCR检测OPG、RANKL mRNA的表达。结果 最后一次用药后2h采血的中药血清可明显上调成骨细胞OPGmRNA表达，且明显下调成骨细胞RANKL mRNA的表达。随血清添加量的增加，对成骨细胞OPG mRNA表达上调作用越强，对成骨细胞RANKL mRNA的表达无影响。结论 实验表明，葛根可能通过上调成骨细胞OPG mRNA的表达，下调成骨细胞RANKL mRNA的表达，抑制破骨细胞的产生和功能，为葛根防治骨质疏松提供了有力的实验依据。
【关键词】 葛根；成骨细胞；OPG；RANKL
【Abstract】 Objective To explore the effects of roots of kudzu vine on the mRNA expression of OPG and RANKL of osteoblasts using RT-PCR. To provide the experimental base for its preventing and treating the OP in clinic， it is urgent to explore the mechanism of roots of kudzu vine anti-osteoporosis in cell and molecular level.Methods 36 SD rats weighting (250±10)g，are randomly divided into two groups. Control group and herb group were administered orally with physiological salt solution and with epimedium sagittatum maxim（2g/ml）twice a day at 10ml/kg body weight per day， respectively for three days. At the third day the serum was collected from the femoral artery at one hour， two hours and four hours after the last administration of medicine. Primary rat osteoblasts were isolated from newborn mouse calvariae. The third passage osteoblasts were plated at the density of 5×104/ml in 75ml culture flask， twenty four hours later treatment factors were added. Total RAN was extracted from osteoblasts using guanidine， and mRNA expression of OPG and RANKL were examined using RT-PCR.Results Serum of roots of kudzu vine can up-regulate mRNA expression of OPG of osteoblasts and down-regulate mRNA expression of RANKL of osteoblasts.The effect of serum of medicine harvested at 2h after the last medicine administration is the most strong and the effect for OPG was in dose-dependent manner ，however the effect for RANKL was not in dose-dependent manner.Conclusion The experiment showes roots of kudzu vine might inhibit the generate and function of osteoclast by up-regulating the mRNA expression of OPG and down-regulating mRNA expression of RANKL. It has provided the experiment base for roots of kudzu vine preventing and treating the OP in clinic.
【Key words】 roots of kudzu vine；osteoblast；OPG；RANKL
随着老龄化社会的到来，骨质疏松症已成为世界广泛的问题之一。许多激素及细胞因子通过调节破骨细胞和成骨细胞这两类细胞的数量和活性，使骨量维持动态平衡。成骨细胞骨形成功能的减退和/或破骨细胞骨吸收作用的增强可造成代谢性骨病，如骨质疏松。近年来发现的护骨素［1，2］（osteoprotegerin，OPG）、核因子-κB受体活化子配体［3，4］（receptor activator of NF-KappaB ligand ，RANKL）及其相关因子核因子-κＢ受体活化子［5］（receptor activator of NF-KappaB，RANK ）对骨质疏松的发病机制和防治有了新的认识，并且成为骨代谢研究的新的靶点。OPG作为RANKL的诱骗受体阻断其与表达于破骨细胞前体细胞和成熟的破骨细胞表面的功能性受体RANK的作用，从而抑制破骨细胞的分化和功能。OPG和 RANKL基因在成骨细胞均可表达，由成骨细胞分泌的OPG及RANKL在破骨细胞分化、成熟和信号传递过程中起着重要的调节作用。
现代医学证明葛根（roots of kudzu vine）主要的有效成分为异黄酮类，其有雌激素样作用，属于天然的植物雌激素(phytoestrogen，PE)。本研究用RT-PCR的方法观察含葛根中药血清对成骨细胞细胞因子：OPG、 RANKL mRNA表达的影响，力求从细胞水平和分子水平对葛根抗骨质疏松的机制进行探讨，为葛根应用于临床防治骨质疏松提供有力的实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 出生24h内的SD大鼠，(250±10)g SD大鼠，由河北医科大学实验动物中心提供。
1.2 药物与试剂 葛根（购于保定市第三中心医院），DMEM培养基（GiBco），胰蛋白酶（GiBco），Ⅱ型胶原酶（Sigma），新生小牛血清（NCF）（北京鼎国生物试剂公司），RT-PCR试剂（北京赛百盛基因技术公司），PCR引物：OPG(gene bank：NM-012870) 北京赛百盛基因技术公司合成，上游引物：5′-CGAGTGATGAATGCGTGTA-3′ 下游引物：5′-TTCTGAAGTAGCAGGAGGC-3′ 扩增产物为301 bp； OPGL(gene bank： NM-057149)北京赛百盛基因技术公司合成，上游引物：5′-CCATCGGGTTCCCATAAAG-3′ 下游引物：5′-TGAAGCAAATGTTGGCGTA-3′ 扩增产物为 142bp；β-actin(gene bank： NM-031144)上海捷倍斯公司合成，上游引物：5′-GAGACCTTCAAGACCCCAGCC-3′ 下游引物：5′-TCGGGGCATCGGAACCGCTCA -3′ 扩增产物为404bp。
1.3 主要器械与仪器 CO2培养箱(德国Heraus)，倒置显微镜（重庆光学仪器厂），PCR扩增仪（美国 MJ Research公司产品）。
1.4 方法
1.4.1 成骨细胞培养 出生24h内的SD大鼠，75%乙醇浸泡5min ，无菌取颅盖骨，在D-Hanks液中认真刮去结缔组织，清洗3次后将剪碎的骨片于0.25%胰蛋白酶室温消化15min，0.1%Ⅱ胶原酶室温消化45min，移入 DMEM（含20%小牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素）培养基，37℃ 5%CO2培养箱中培养，3天后换培养基，待细胞80%汇合后用0.25%胰蛋白酶消化，以含10%NCF的DMEM培养基吹打，制成细胞悬液，计数后传代。
1.4.2 动物分组及给药 中药葛根常规煎熬，加热浓缩终浓度为2g/ml 。SD大鼠32只， 雌雄兼用，随机分为2组： 中药组，生理盐水组(对照组)， 20g/kg·d 1日2次灌胃，连续3天。
1.4.3 含药血清制备 最后一次灌胃后分别1h、2h、3h无菌操作股动脉采血，将大鼠血离心3000r/min 取血清，每组血清混匀，于56℃水浴30min灭活，-20℃保存，用时0.22μm微孔滤膜过滤，用无血清DMEM配成所需浓度。
1.4.4 成骨细胞OPG及RANKL mRNA表达的检测
1.4.4.1 成骨细胞中总RNA的提取 成骨细胞传至第三代，将细胞用0.25%胰蛋白消化，细胞计数后用含10%小牛血清的DMEM培养基制成5×104/ml细胞悬液，接种于75ml培养瓶，37℃ 5%CO2培养箱中培养，24h待细胞贴壁后加入不同时效和量效的中药血清和对照组血清，每组重复4瓶，培养6天后采用异硫氰酸胍一步法提取总RAN，-70℃保存。
1.4.4.2 RNA鉴定和定量 取5μl RNA溶液经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度和完整性，紫外灯下观察；另取5μl RNA溶液稀释后于260nm、280nm测定光密度，计算RNA含量及OD260nm/OD280nm 比值以确定其纯度。选OD260nm/OD280nm比值在1.8～2.0间的RNA作RT-PCR。
1.4.4.3 RT-PCR
1.4.4.3.1 cDNA合成 取模板RNA 1.5μg和下游引物15pmol，混匀，70℃孵育5min，放入冰浴中，在反应体系中加入孵育的混合物和上游引物15pmol，补无菌三蒸水至20μl，混匀后短暂离心。放入PCR仪中，42℃60min，94℃5min。
1.4.4.3.2 PCR 94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸5min。
1.4.4.3.3 PCR产物分析 PCR产物5μl上样于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压为3～5V/cm，电泳缓冲液为0.5×TBE，30min后停止电泳。紫外灯下观察并用数码相机照相，图像用Adobe Photoshop软件去色，转换为TIF格式后用Tatallab v1.10软件分析，得到待测的RNA扩增产物与内参照β-actin RNA扩增产物的光密度值，计算每一样品和其内参照的比值：Asample/Aβ-actin以此作为目的基因RNA的相对表达量。
1.4.5 数据处理 数据采用SAS软件处理，均以x±s表示，两样本均数比较应用方差齐性检验、t检验和t′检验，组间比较用方差分析检验。
2 结果
2.1 不同时间中药血清对成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达情况的影响 见表1、表2。