医药学论文：五味子水煎物HPLC指纹图谱的研究

【摘要】 目的 建立五味子水煎物的HPLC指纹图谱。方法 应用HPLC法Kromasil C１８分析柱，甲醇和水二元梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长254nm。结果 运用梯度洗脱能很好的分离五味子水煎物的各类成分，五味子水煎物的指纹图谱相似度均＞0.90，标示18个共有峰。结论 所建立的HPLC指纹图谱可用于五味子水煎物的质量控制。
【关键词】 五味子水煎物；HPLC；指纹图谱
【Abstract】 Objective Setting up HPLC finger-print chromatogram of decoction of Schisandra chinensis.Methods Kromasil C１８ column，methanol-water gradient elution，flow rate 1.0ml·min－１，wavelength 254nm.Results The compounds in decoction of Schisandra chinensis were separated with gradient elution of methanol-water.The similarities of HPLC finger-print chromatogram of decoction of Schisandra chinensis were above 0.90.There were 18 common peaks.Conclusion The HPLC finger-print chromatogram can be used to control the quality of decoction of Schisandra chinensis.
【Key words】 decoction of Schisandra chinensis；HPLC；finger-print chromatogram
五味子性温，味酸，既能补益心肾，又能宁心安神。适用于阴血亏损，心神不安之心悸、失眠、健忘、多梦等病症。中医临床常用五味子及其复方水煎液进行睡眠障碍的治疗［１～３］，并取得了较好的疗效。经我研究室药理学实验证明，五味子水煎物能延长戊巴比妥钠所致小鼠及大鼠睡眠的时间，具有显著改善睡眠的作用。为了利于五味子的药效学研究，有效控制其质量，本实验建立了五味子水煎物的指纹图谱，确定其共有峰18个。
1 仪器与试剂
Waters 高效液相色谱仪2695型四元液相色谱泵，2996型二极管阵列检测器，Millennium32色谱工作站；甲醇(色谱醇)，超纯水，其余试剂均为分析纯。
对照品五味子醇甲(批号110857-200304)、五味子甲素(批号0764-200006)、五味子乙素(批号0706-200003)由中国生物制品检定所提供。
药材五味子由黑龙江省神树林场提供，经黑龙江中医药大学药学教研室都晓伟教授鉴定为木兰科植物五味子Schlisandra chinensis(Turcz)Bail的干燥成熟果实。
2 实验方法与结果
2.1 色谱分析条件 中科院大连物化所Kromasil C１８色谱柱(4.6mm×20mm，5μm)，流动相：甲醇(A)-水(B)梯度洗脱，0～15min(56%A，44%B)，15～50min(56%～５９％Ａ，４４％～４１％Ｂ），５０～５６min(59%～６５％Ａ，４１％～３５％Ｂ），５６～６５min(65%～67%A，35%～33%B)，65～100min(67%～８５％Ａ，３３％～１５％B)；柱温30℃，流速1.0ml/min，检测波长254mm。见图1。

 

 

a 五味子水煎液 b对照品
图1 五味子水煎物与对照品的HPLC指纹图谱

2.2 供试品的制备 五味子水煎物的制备：取五味子原药材30g，粉碎，加适量水浸泡2h，煮沸30min，过滤，将滤渣再加适量水煎煮20min，合并2次滤液，水浴蒸干(70℃)，碾成细粉，重13g。1g干膏粉相当于原药材2.31g。
取0.1g水煎物，用甲醇超声提取2次，每次加甲醇5ml，超声15min，过滤，合并2次滤液，用甲醇定容至10ml。溶液经0.45μm微孔滤膜过滤，进行HPLC分析。
2.3 参照物溶液的制备 精密称取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素对照品，加甲醇制成每毫升含五味子醇甲0.043mg、五味子甲素0.009mg、五味子乙素0.031mg的对照品溶液。
2.4 指纹峰的标定 采用相对保留时间标定指纹峰，以五味子醇甲对照品为参照物，把各色谱峰保留时间与同一图谱中五味子醇甲保留时间的比值作为各色谱峰的相对保留时间。
2.5 指纹峰的峰面积比值 精密吸取对照品溶液10μl，按上述色谱条件进行测定，以所得的五味子醇甲峰面积作为1，计算各样品图谱中色谱峰的峰面积比值。
2.6 方法学考察
2.6.1 精密度 取同一份五味子药材水煎物供试品，连续进样5次，测定HPLC色谱，测得其各色谱峰相对峰面积的RSD< 3%，相对保留时间的RSD< 1%(n=5)，表明仪器精密度良好。
2.6.2 稳定性 取同一份五味子药材水煎物供试品，每6h进样分析，结果各共有峰相对峰面积的RSD< 3%，相对保留时间< 1%(n=5)，表明样品在24h内稳定。
2.6.3 重现性 取同一批五味子水煎物，按样品制备方法制备供试品溶液5份，测定HPLC色谱，结果各共有峰相对峰面积的RSD< 3%，相对保留时间< 1%(n=5)，表明方法重现性良好。
2.6.4 色谱柱的选择 按拟定的色谱条件，使用中科院大连物化所Kromasil C１８色谱柱(4.6mm×２００mm，5μm)、中科院大连物化所Nucleosil C１８(4.6mm×２５０mm，5μm)及Waters Symmetry Shield RP18色谱柱(3.9mm×１５０mm，5μm)对同一样品进行分析，结果表明Kromasil C18色谱柱分析的色谱图峰形好，出峰数目多，各色谱峰相互之间分离度好。故本实验选用了中科院大连物化所Kromasil C１8色谱柱，保护柱为大连依利特公司C１８保护柱。