医药学论文：注射用重组双功能水蛭素产品质量研究

【摘要】 本实验室构建了分泌型高效表达重组双功能水蛭素 (RGD-Hirudin) 的工程酵母，经发酵、纯化，获得重组双功能水蛭素纯品，其原液经质量分析，符合国家静脉注射用药的标准，可以用于制备静脉注射用粉针剂。
【关键词】 注射用重组双功能水蛭素；质量研究
【Abstract】 The expression plasmid，HD-pPIC9K，was contructed by inserting cDNA of RGD-hirudfin (RGD-Hirudin) in yeast expression vector pPIC9K. This clone was fermented for 3 days，and the purified RGD-Hirudin was gained after purification. Quality analyses were tested. The RGD-Hirudin was measured up to standard of injection.

天然水蛭素是凝血酶的特异抑制剂，从医用水蛭的唾液腺中提取而得，可与凝血酶形成摩尔比为1:1的非共价相结合的可逆复合物，对凝血酶有很高的亲和力，使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力，抑制纤维蛋白的形成，因此，低浓度的水蛭素可有效地抑制血液凝固［1］。
我们在保留天然水蛭素原有的生物学作用的基础上，将 RGD 编码顺序融合在天然水蛭素 cDNA 基因中［2～5］。构建了含RGD编码顺序的水蛭素cDNA克隆HD-pPIC9K，表达质粒转化毕赤酵母后，经筛选获得高表达菌株，并建立工程菌株，实现了高效、分泌型表达 (另文发表)。
本文重点报道重组双功能水蛭素原液的质量研究。
1 材料与方法
1.1 抗凝比活性测定
1.1.1 试剂的配制 0.5%纤维蛋白原：纤维蛋白原(上海莱士血制品有限公司)0.5g，以100ml生理盐水溶解。凝血酶：中国生物制品检定所制备的凝血酶，依照标示量，用生理盐水复溶后成100NIU/ml。阴性对照：以生理盐水为样品，凝血酶加入后立即凝固。标准对照：德国 Hochest 公司生产的 Refludan，按照其标示活性溶解分装成 1600ATU/支 (即0.1mg/支)，冻干，具体操作步骤按说明书进行。
1.1.2 方法 凝血酶滴定法［1］(所有过程在37℃水浴中操作)。
1.1.3 抗凝活性计算 抗凝活性 (ATU/ml)=(n-1)×100×稀释倍数，n为添加凝血酶的次数，1为扣除本底1次(即最后一次加入凝血酶，纤维蛋白原凝固)，100为凝血酶活性单位100 NIU/ml，稀释倍数为所测定样品的稀释倍数。
1.1.4 蛋白含量测定 按改良Lowry法进行［6］。
1.1.5 抗凝比活性 抗凝比活性 (ATU/mg)＝单位抗凝活性 (ATU/ml) / 单位蛋白含量 (mg/ml)。
1.2 抗血小板聚集比活性测定［7］
1.2.1 试剂的配制 ADP：Sigma公司，用生理盐水溶解并稀释，配成400μmol/L贮存液，-20℃保存。
1.2.2 血小板来源 正常志愿者。
1.2.3 仪器 血小板聚集仪(上海斯隆医电设备有限公司)。
1.2.4 方法 按说明书操作。
1.2.5 结果判定 血小板聚集抑制率：以未用药测得的血小板聚集率作为空白对照，体外给药后，测得的血小板聚集率除以空白对照所得的比值为相对聚集率，此相对聚集率与1的差值即血小板聚集抑制率。
血小板聚集抑制率＝1－(用药后测得的血小板聚集率/空白对照)
1.3 纯度测定 高效液相色谱法(HPLC)［6］。色谱主机：SHIMAZU， LC-10AD；色谱柱：DELTA PAK C18-300A，3.9mm×15cm；流动相：A：水+0.1%TFA；流动相：B：90%乙腈+0.1%TFA；梯度：100min内，流动相B从0%到100%；流速：0.2ml/min；样品浓度：1mg/ml；上样量：20μl；检测波长：280nm。
1.4 肽图分析 TPCK处理的胰蛋白酶酶解RGD-Hirudin样品和理化对照品，分别以C8柱反相层析柱，0.1% TFA-H2O/0.1% TFA-乙腈为流动相，214nm波长检测，并用质谱测定各肽段分子量，计算总分子量［6］。
1.5 紫外光谱扫描 在200～400nm波长范围内扫描RGD-Hirudin样品和理化对照品［6］。
1.6 残留工程菌蛋白含量测定
1.6.1 Pichia 酵母全菌蛋白制备 Pichia 酵母在YPD培养基中30℃培养，菌体超声波/机械破碎，得蛋白初提物水溶液，Lowry法定量。
1.6.2 抗Pichia酵母全菌蛋白多克隆抗体制备 免疫动物：新西兰大白兔 (2.5kg，雄性)；免疫蛋白：上述Pichia 酵母全菌蛋白(20mg/只)，体积比1:1与完全福氏佐剂混合。免疫方法：背部皮下多点注射(1ml/点)，每周1次。多抗滴度：免疫4周后，取血，分离血清，双扩散法测定其效价，若高于1:16，即颈动脉放血，分离血清(抗酵母全菌蛋白多抗)；若低于1:16，则继续按上述方法免疫动物，直至效价高于1:16为止。
1.6.3 残留工程菌蛋白含量测定(ELISA) Pichia酵母全菌蛋白系列浓度：100ng/ml、80ng/ml、60ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、0ng/ml。样品：1mg/ml。一抗：即自制抗Pichia 酵母全菌蛋白多克隆抗体，稀释度为1:100。二抗：华美试剂公司，羊抗兔IgG-HRP，稀释度为1:1000。显色方法：邻苯二胺/H2O2/pH5柠檬酸缓冲液。比色方法：测定波长：492nm，参比波长：655nm。
2 结果
2.1 抗凝比活性 见表1。