医药学论文：散发性结直肠癌hMLH1蛋白表达的研究

［摘 要］ 目的：通过测定错配修复基因hMLH1在散发性结直肠癌(CRC)组织中的蛋白表达变化，分析其在散发性CRC发生机制中所起的作用，并评估其可能的临床意义。方法：采用PV-6000二步法免疫组化检测技术对60例散发性CRC石蜡切片进行hMLH1表达的检测。结果：60例散发性CRC hMLH1缺失表达11例(18.3%，11/60)，hMLH1缺失表达与患者年龄、肿瘤部位、组织学类型和分化程度密切相关(P＜0.05或P＜0.01)，而与患者性别、肿瘤大体类型、肿块大小、浸润深度、淋巴结及远处转移与否和患者的Dukes分期均无显著相关性(P＞0.05)。结论：一定比例的散发性CRC中存在MMR基因的缺陷，并具有相对特殊的临床病理特征。

 

　　［关键词］ 结直肠肿瘤；错配修复基因；hMLH1基因；免疫组织化学

 

　　Research on Expression of hMLH1 In Sporadic Colorectal Carcinoma

 

 

 

Abstract：Objective To analyse the role of hMLH1 in the carcinogenesis of sporadic colorectal carcinoma and to evaluate its possible clinical significance, We deter mined the expression of mismatch repair genehMLH1 in sporadic colorectal carcinoma. Methods The expression of mismatch repair genehMLH1 in 60 cases of sporadic colorectal carcinoma were analyzed using PV6000 immunohistochemical method. Results Loss of hMLH1 expression were found in 11 cases (11/60,18.3%) sporadic colorectal carcinoma. Loss of hMLH1 expression did not correlate with patient's gender, tumor gross type, tumor size, invasive depth, lymph node metastasis, distant metastasis and Dukes stage(P＞0.05), but was closely related to patient's age, tumor location,histological type andhistological grade (P＜0.05 or P＜0.01). Conclusion There was a subset of sporadic colorectal carcinoma displaying MMR defective, with specially clinical and pathological features.

 

 

　　Key Words: Colorectal carcinoma; Mismatch repair gene;hMLH1 gene; Immunohistochemistry
结直肠癌(colorectalcarcinoma，CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一，随着医学生物技术以及分子生物学的飞速发展，人们已认识到CRC的发生发展并不遵循单一的途径［1］。本研究旨在用免疫组化方法检测错配修复基因hMLH1在散发性CRC组织的蛋白表达状况，分析其与临床病理学参数之间的关系，探讨hMLH1基因在散发性CRC发病机制中所起的作用，为指导临床实践提供可靠的理论依据。

 

　　1 材料和方法

 

　　1.1 病例选择与临床资料 收集青岛大学医学院附属医院2004年1月至2006年5月临床资料完整的散发性CRC常规石蜡包埋组织标本60例，其中男性38例，女性22例。年龄30岁~88岁，平均年龄(55.65±11.36)岁。所有标本切片均经两位资深病理医师确诊，不包括遗传性非息肉病性大肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)患者，所有病例手术前均无系统的放疗和化疗病史。

 

　　1.2 免疫组织化学检测方法

 

　　1.2.1 主要试剂和工作浓度 兔抗人hMLH1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，工作浓度分别为1∶50。PV6000二步法免疫组化检测试剂购自美国Zymed公司。

 

　　1.2.2 实验方法 取存档蜡块厚3 μｍ连续切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后置于新鲜配制的3%H2O2去离子水室温孵育10 min，然后蒸馏水冲洗。将切片放入盛有1 mM　EDTA(pH 8.0，1∶50)抗原修复液的容器中，置微波炉内进行微波修复，室温下冷却，PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤。滴加一抗，室温下孵育3 h。PBS洗涤，滴加PV6000二抗，置于37 ℃电热恒温水箱孵育20 min，PBS洗涤，切片在0.04% DAB(二氨基联苯胺盐酸盐)+1% H2O2中显色，见棕黄色颗粒后终止反应。苏木精复染，盐酸酒精分化，氨水反兰。常规脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。用PBS取代一抗作阴性对照。

 

　　1.3 结果判断标准 所有切片均由两位病理科资深专家阅片。每张切片选择有代表性区域，并避开切片的周边区域，光镜下随机观察10个高倍镜视野，记录10×100个阳性细胞的百分比。阳性结果参照Friedrichs等［2］的免疫组化评判标准，分别观察染色强度和阳性细胞所占的百分数，先按染色强度计分(染色深浅需与背景着色相对比)，0分为无着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再按阳性细胞所占百分比计分，0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为阳性细胞占11%~50%，3分为阳性细胞占51%~80%，4分为阳性细胞＞80%。将染色强度与阳性细胞百分比计分的积分相乘，乘积≥2分为hMLH1蛋白表达正常，乘积0分~1分为hMLH1蛋白表达缺失。hMLH1蛋白阳性染色定位在黏膜上皮细胞胞浆或核染色，癌旁正常肠黏膜和淋巴细胞为内对照阳性。