医药学论文：ELISA检测p24抗原用于诊断HIV感染的研究现状

［关键词］ ELISA；p24；HIV

 

　　1 HIV感染实验诊断的研究概况

 

　　HIV主要通过性接触、血液和母婴传播。近年来，欠发达国家的感染人数超过发达国家。预计到2010年我国感染HIV的人数将超过1 000万。目前测定血清HIV抗体是诊断HIV感染的常规实验方法，但是测定HIV抗体有局限性：有超过70%的HIV感染者在感染6个月后才能检测出抗体，在同性恋群体，这个数字超过80%，检测技术增加了HIV"窗口期"传播的危险［1］；新生儿产生抗体需要出生1年后，来自母亲的HIV抗体会致使假阳性产生；HIV抗体持续存在，艾滋病晚期时消失，无法作为治疗监测的稳定指标。

 

　　2 p24的来源和实验价值

 

　　24 kDa的蛋白质p24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之间高度保守，缺失p24会导致病毒无法正常组装。衣壳蛋白p24特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，可以用于HIV感染的早期诊断，抗HIV药物疗效的检测及HIV感染者发展为艾滋病的动态观察。HIV1感染机体后, 感染者血液中最早出现的是病毒gag基因表达产物p24抗原, 然后才出现相应的特异性抗HIV抗体, 以后随抗体滴度的升高p24抗原含量呈逐渐下降的趋势, 以至检测不出。 在病情发展后期, 病毒大量复制, 机体免疫力下降, 所产生的抗体不足以中和病毒抗原时, p24抗原在血中又可测出。HIV阳性母亲所生育的婴儿30%可能已受到感染,但由于婴儿体内母源性抗HIV抗体可持续13个月～21个月之久,常规检测抗HIV抗体不适用于婴儿,而p24抗原的检测则可弥补这一不足。

 

　　3 p24抗原用于HIV感染的诊断

 

　　HIV1和HIV2 的p24抗原不同，但有轻微的交叉反应。因HIV2主要局限于西部非洲，目前p24抗原的研究主要针对HIV1感染。Schüpbach J比较245份HIV1感染成人不同阶段的血样，发现血浆中p24抗原浓度高于血清［2］，因此建议检测血浆中p24抗原。p24抗原测定主要存在的问题：机体产生针对p24的抗体，抗原抗体结合形成免疫复合物。感染初期，随着抗体大量产生，免疫复合物形成，游离p24抗原减少，致使ELISA测定p24抗原得出假阴性结果。为提高p24检测HIV感染的敏感度，在检测之前需要将抗原抗体复合物分开。将抗原从免疫复合物上分开主要通过加热和酸碱中和。酶标记抗原斑点试验（Enzyme Labelled Antigen Spot Test,ELAST）能显著提高ELISA实验的敏感度和特异度。

 

　　3.1 实验步骤 患者血浆用0.5%三硝基甲苯稀释至1∶6比例后100 ℃加热5 min。已知浓度0 pg/ml、0.5 pg/ml、1 pg/ml、2.5 pg/ml、5 pg/ml、20 pg/ml、40 pg/ml、80 pg/ml的p24抗原作为对照同时操作。所有标本（100 μl/份）加入微孔中37 ℃孵育60 min后，用稀释的磷酸盐缓冲液（PBS）洗板后，加入100 μl用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗p24抗体，再37 ℃孵育60 min。洗板后，来自ELAST ELISA系统的100 μl生物素酪胺加入微孔中，室温下孵育60 min。再次洗板后，来自ELAST ELISA系统的链霉素辣根过氧化物酶用1%小牛血清PBS吐温20 ml溶液稀释至1∶500，取100 μl加入每个孔中，室温下孵育30 min后洗板。100 μl四甲基联苯胺底物加入微孔中，室温下孵育30 min。然后加入100 μl 1 mol/L的硫酸终止显色反应。15 min内450 nm测定吸光度，当吸光度＞0.12时被认为是阳性［3］。

 

　　3.2 敏感度和特异度 Sutthent R等发现采取ELAST ELISA方法测定血浆p24的线性范围是0.5 pg/ml～80 pg/ml。针对新生儿感染HIV的检测，p24检测的敏感度(100%)与HIV1 RNA检测的敏感度相同，高于检测HIV1 DNA（61.9%），三种方法的特异度都可达100%［3］。Schupbach J等研究390例HIV感染母亲生产的婴儿，发现经过中和抗体，p24检测的特异度可达100%，在125例感染HIV的儿童中，p24检测敏感度可达97%高于PCR检测HIV DNA（96%）和病毒培养结果（77%）。普通采用免疫复合物分离技术测定p24抗原的方法敏感度低，而且只能检出50%没有症状的HIV患者。如今已有商品化试剂盒（bioMerieux）采用ELAST ELISA方法检测p24抗原，其敏感度和特异度能和PCR检测HIV1 RNA相媲美。

 

　　4 检测p24抗原的方法临床价值评判

 

　　4.1 p24抗原用于HIV1的早期诊断 成人HIV感染至抗体阳转需要6个月时间［1］。p24抗原在感染早期，病毒大量复制而抗体产生很少时就能被检测出来［4］。通过检测血浆p24抗原，可以将"窗口期"减短至20 d，此时抗体尚为阴性［5，6］。因此对献血员进行p24抗原筛查很有必要性。美国FDA已规定, 自1995年8月起, 所有全血、 成分血、 白细胞和原料血浆的献血员, 在献血前必须进行HIV1抗原的筛选。HIV感染母亲是所生育的新生儿中30%会感染HIV。检测脐带血和新生儿血浆中的p24抗原可判断新生儿感染HIV是先天性还是在产道中感染所致。感染HIV新生儿早期使用齐多夫定（zidovudin）可降低HIV母婴传播的危险率［7］。

 

　　4.2 p24抗原用于HIV治疗的监测 目前主要是把血液中HIV1 RNA的数量作为何时开始治疗以及治疗是否有效的标志。因p24抗原感染后20 d即可从血浆中检测出来， 并且伴随抗病毒治疗，血液循环中的p24抗原的量会减少。采用ELAST ELISA测定p24抗原的方法，最低可检测到0.5 pg/ml的浓度，相当于每毫升有100个病毒，而HIV1 RNA检测正常低限是小于400拷贝/ml。故ELAST ELISA测p24抗原的阈值小于测定HIV1 RNA，并且两种方法的敏感度和特异度都相同。相比之下，p24抗原更适合作为治疗何时开始以及治疗是否有效的标志物。美国艾滋病临床实验组认为，血浆p24浓度下降一半表明抗病毒治疗有效，p24浓度持续升高表明缺乏有效治疗［2］。