医药学论文：免疫组化染色质量控制在鼻咽组织切片中的应用

［摘 要］ 目的：建立鼻咽组织常规制片及其免疫组化的标准化实验流程，达到临床病理检验质量控制的要求及日后研究的需要。方法：详细介绍鼻咽组织常规制片及其免疫组化染色的方法以及质量控制环节。结果：用此法制备的鼻咽组织免疫组化切片染色结果稳定可靠、特异性强、敏感性高。结论：此实验流程可改进和提高鼻咽组织免疫组化染色的质量。

 

　　［关键词］ 鼻咽组织;免疫组织化学;标准化;质量控制

 

　　Quality Control of Immunohistochemical Stainig in Slice of Nasopharynx Tissues

 

　　Abstract： Objective To establish a standard empirical process of immunohistochemical staining and slice making of nasopharynx tissues catering to the requirement for pathological diagnosis and research in the future.Methods Introducing the methods of immunohistochemical staining and slice making of nasopharynx tissues as well as the link of quality control in detail. Results The results shown that method has three features: stable and reliable, strong specificity， and high sensitivity. Conclusion This method can improve the quality ofimmunohistochemical staining of nasopharynx tissue.

 

　　Key words:Nasopharynxtissue;Immunohistochemistry;Qualitycontrol

 

　　鼻咽癌是我国华南地区常见的恶性肿瘤之一，其发生的病因、发病机制以及发生发展也是我们广东医学院病理学教研室一直关注和研究的课题。由于鼻咽组织活检时不易大量取材，且组织中淋巴细胞较多，组织质地较脆，石蜡切片常出现组织碎裂、染色发白、模糊不清、细胞固缩等现象，另外淋巴细胞、网状细胞表面上的Fc受体及一些反应性淋巴细胞干扰免疫组化的结果，导致制作满意的鼻咽组织石蜡切片及其免疫组化染色较为困难，继而影响病理诊断及后续的科研工作。为此，我们摸索自己实验室的工作条件及各种抗体最佳的实验条件来制定标准化实验流程，稳定鼻咽组织石蜡切片及其免疫组化染色的质量，现报道如下。

 

　　1 材料与方法

 

　　1．1 材料 来自广东医学院附属医院临床送检的鼻咽标本。

 

　　1．2 主要仪器 轮转切片机(德国,Leica)、家用高压锅(广州)。

 

　　1．3 主要试剂 p53、PCNA、Ecadherin等鼠抗人单克隆抗体、多克隆抗体及免疫组化染色SP试剂盒、浓缩型DAB试剂盒、抗体稀释液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

 

　　1．4 组织切片的制备 鼻咽组织离体时立即用生理盐水轻轻洗去组织上的血液及黏液,随后即用4%中性缓冲甲醛液固定,并及时送病理科作进一步处理。4%中性缓冲甲醛液固定不宜超过18 h。脱水从低浓度乙醇到高浓度乙醇梯度脱水,级差以10%为宜，一般从60%乙醇开始30 min,70%乙醇30 min,80%乙醇25 min,95%乙醇25 min,无水乙醇Ⅰ20 min,无水乙醇Ⅱ20 min;二甲苯Ⅰ10 min,二甲苯Ⅱ10 min;58 ℃石蜡浸蜡，期间最好更换1次，浸蜡3 h后60 ℃石蜡包埋制成蜡块。一次性刀片进行切片，切片厚度为2 μm～3 μm,40 ℃以下水温展片,65 ℃温箱烤片1 h～4 h。

 

　　1．5 免疫组化染色方法 切片烤片后脱蜡至水，然后蒸馏水洗两次，高压锅内放约5 cm深的自来水，大火加热至沸腾，再将柠檬酸盐缓冲液(200 ml～400 ml pH 6.0)倒入搪瓷杯中，把切片置于耐高温塑料切片架上放入盛有缓冲液的搪瓷杯中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续中火加热至喷气，从喷气开始记时1 min后，压力锅离开火源，冷却至室温(稍冷后,可在自来水龙头下流水加速冷却)，取出切片，先用蒸馏水冲洗两次之后用PBS(pH 7.2～7.4)冲洗，余下按免疫组化步骤选择不同的抗体进行染色。

 

　　2 结果

 

　　鼻咽切片组织无收缩、开裂，组织结构、细胞形态清晰，鼻咽癌癌细胞及各种炎症细胞能清晰辨认，HE染色鲜艳，细胞核呈鲜明的蓝色,细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色、桃红色，核仁呈红色，对比度良好(见图1)。免疫组化染色结果为病变组织结构完整、无脱片现象，阳性与阴性对比明显，阳性物质定位准确；背景干净、清晰，无非特异性着色(图2),组织结构与细胞轮廓完整、清晰，染色结果稳定可靠、敏感性高、特异性强、细胞核呈蓝色、适合显微照相等。

 

　　图1 鼻咽癌组织(HE 400)（略）

 

　　图2 Ecadherin在鼻咽慢性炎上皮的强阳性表达(SP 400)（略）

 

　　3 讨论

 

　　免疫组织化学由于其具有的复杂性，在技术应用过程中存在不少问题，直接或间接地影响了最终的病理诊断，应予以重视以下几方面，才能从总体上保证鼻咽组织免疫组化染色的质量。

 

　　3.1 制作优质石蜡切片是做好鼻咽组织免疫组化染色的基础 取材时鼻咽组织上的血液及黏液将影响固定液的渗透和干扰免疫组化染色的结果，而且鼻咽组织由于组织中淋巴细胞比较丰富和致密，间质成分较少是难以制作优质石蜡切片的主要原因，所以组织固定的好坏是影响免疫组化结果的关键因素。因此有条件时，鼻咽组织离体时立即用生理盐水洗去组织上的血液和黏液，并用4%中性缓冲甲醛液固定；或者用4%中性缓冲甲醛液固定后及时送病理科做进一步处理：即轻轻晃动瓶内固定液,利用原有固定液洗去鼻咽组织上的血液及黏液,再换一次4%中性缓冲甲醛液固定。乙醇脱水尽可能从较低浓度起始，以免组织过度收缩。常温下二甲苯透明时间≤30 min，不然组织变脆。制片严格按操作程序进行，否则是免疫组化产生假阳性、假阴性或脱片的主要原因。