医药学论文：信号放大时间分辨荧光分析技术的研究进展及应用

【摘要】 信号放大时间分辨荧光分析技术是一种新型的超微量的标记分析技术。它是以生物信号放大为基础，以镧系元素螯合物为标记物，以时间分辨和波长分辨为测量方法，充分利用了酶标记分析和PCR扩增等分析技术优点的技术。它的独特优点是非同位素和超灵敏度。本综述介绍了TRFA的特点以及酶放大、二次酶放大、铕纳米颗粒、滚动循环放大、免疫PCR和荧光淬灭分析等信号放大时间分辨荧光分析技术的研究进展及应用。信号放大时间分辨荧光分析技术在生物分析中极其广泛的应用，显示出具有很好的发展前景。

 

　　【关键词】 信号放大；时间分辨荧光分析；镧系元素螯合物

 

　　Studies and applications of time-resolved fluorescence assay based on signal amplification

 

　　　　【Abstract】 Time-resolved fluorescence assies(TRFA) based on signal amplification are new ultrasensitive labelling assay technologies.The basis is biosignal amplification,the labels are lanthanide chelates,and the detection methods are the time-resolved and wavelength-resolved fluorescence assay in the technologies.In addition,enzyme-labelled assay and PCR amplification et al are used in the technologies.The several main signal amplification methods and amplifications, for example, enzyme-amplification, two-round enzyme-amplification,europium nanopartical,rolling circle amplification,immuno-PCR and fluorescence quenching assay et al, were introduced in the summary. The unique advantages of nonisotope and ultrasensitivity and extensive applications in bioassay shown good prospects of TRFA based on signal amplification.

 

　　【Key words】 signal amplification; time-resolved fluorescence assay; lanthanide chelate

 

　　近些年来，非同位素标记分析技术发展迅速。它主要包括：酶标记分析技术、化学发光分析技术、生物发光分析技术和时间分辨荧光分析技术。信号放大时间分辨荧光分析技术克服了其他技术的缺点，具有非同位素、灵敏度高、标记物制备简单、测量快速和分析动态范围宽等优点，成为一种最有发展前途的非同位素标记分析技术。

 

　　1 信号放大时间分辨荧光分析技术的原理及特点　　

 

　　信号放大时间分辨荧光分析（time-resolved fluorescence assay， TRFA）技术是把生物信号放大、镧系元素螯合物的固有优点以及时间分辨和波长分辨两种测量技术合为一体，极其有效地排除了非特异荧光，测量了特异荧光，因而灵敏度很高。　　

 

　　信号放大时间分辨荧光分析技术的优点归根到底是源于镧系元素螯合物的固有特点［1］。它们是：(1)激发光谱带较宽，可以增加激发能，提高标记物的比活性。(2)发射光谱带很窄，50%发射谱带的宽仅约为10nm，可以利用通带滤光片，只允许峰值波长±5nm谱段通过供测量，在如此窄的谱段内，非特异荧光很少，可有效降低本底荧光，且能量损失也不大。(3)激发光与发射光之间的stokes位移大，有利于排除激发光散射等的干扰。(4)镧系离子螯合物的荧光寿命很长，约1ms,在时间分辨荧光仪上测量时，脉冲光源激发后，可适当延迟一段时间，待其他短半衰期（1～10ns）的非特异荧光完全衰变后再测量，从而极大的降低了本底荧光，实现了时间分辨，灵敏度大大提高。(5)镧系离子由激发态跃迁到基态时发射荧光，在测量时间内可反复激发镧系离子，相当于大大提高了标记比活性。　　

 

　　此外，时间分辨荧光分析技术的分析动态范围宽，可达4～5个数量级；标记物制备简单，稳定性好，有效期长，不受半衰期影响；标记蛋白质时反应条件温和，蛋白质活性受损少；测量快速，易于自动化。

 

　　2 生物素-链霉亲和素系统放大的时间分辨荧光分析　　

 

　　1988年，出现了一种新的双功能螯合剂，称为4,7-双（氯磺酰基苯基）-1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸［4,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline-2,9-dicarboxylic acid,BCPDA］，为了增加生物放大又把生物素-亲合素系统（biotin-avidin system,BAS）引入免疫反应系统。本分析系统的基本原理是：固相McAb与抗原反应后，再加入生物素化McAb，形成免疫反应复合物，再加入通用试剂SA-BCPDA-Eu3+，其中SA是链霉亲合素（streptavidin，SA），借助SA与生物素的高特异和高亲合力的结合，把这种通用试剂连接到免疫反应复合物上，最终形成的复合物为：固相McAb-抗原（标准或样品）-（McAb-生物素）-（SA-BCPDA-Eu3+）［2］。本分析系统的特点是不用增强液，可在固相下直接测荧光。该系统共有三次放大作用，但放大倍数仍然远小于增强液系统，灵敏度可能略低，为此也有学者在最后一步加入增强液，进行液相荧光测定。

 

　　3 酶放大时间分辨荧光分析　　

 

　　酶放大时间分辨荧光分析（enzyme-amplified time-resolved fluorescence assay, EATRFA）系统，它的核心思想是把生物素-链霉亲和素的高亲和力和放大作用、酶放大作用、镧系元素螯合物的特有优点和时间分辨测量技术结合，不用增强液，在液相下测量荧光。