医药学论文：一种提高组织DNA抽提得率的方法

【摘要】 目的 采用常规酚-氯仿抽提法方法提取组织DNA，通过延长水浴时间提高提取DNA得率。方法 各组设置不同的水浴时间，比较所提DNA得率。结果 用酚-氯仿提取肝脏DNA，随着水浴时间的延长（2.5～7.5h），DNA提取得率由每100mg肝脏组织中得到341.4μg提高到701.9μg。结论 该方法适用于用酚-氯仿对少量组织需提取较大量DNA的实验，为下一步的实验研究做准备。
【关键词】 酚-氯仿;DNA得率
基因组DNA在分子生物学研究中应用广泛。酚-氯仿提取组织DNA的方法从上个世纪八十年代开始应用，以其操作简便，效果好而一直方兴未艾。本实验旨在对酚-氯仿提取组织基因组DNA的过程加以改进，从少量组织中提取较大量DNA，用于下一步实验研究［1］。
1 材料与方法
1.1 材料 每个样本取SD大鼠肝脏0.1g，共做24个样 本，以8个样本为一组，每组水浴时间不同，Ⅰ组水浴2.5h；Ⅱ组水浴5h；Ⅲ组水浴7.5h。
1.2 主要试剂 细胞裂解液：30mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，0.1 mM NaCl，pH 8.0；10mg/ml蛋白酶K、SDS、饱和 酚、氯仿、异戊醇、无水酒精、1mol/L TE缓冲液。
1.3 方法
1.3.1 酚-氯仿提取组织基因组DNA［2］ (1)取100mg肝脏加1ml细胞裂解液，用玻璃匀浆器匀浆；(2)匀浆液倒入2ml塑料离心管中，加20μl蛋白酶K，再加SDS至终浓度为1％，上下颠倒混匀；(3)混合液置于55℃水浴，水浴时间分别为Ⅰ组2.5h、Ⅱ组5h、Ⅲ 组7.5h；(4)水浴完毕后，向匀浆液中按1：1比例加酚/氯仿/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻震荡混匀5min，12000g离心5min；(5)吸上层水相800μl于一灭菌塑料离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min，12000g离心5 min；(6)吸上层水相500μl于一塑料离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h或液氮中放置5min；(7)12000g离心5min，沉淀DNA,倾去上清液；(8)于沉淀中加入75%乙醇溶液500μl，轻轻混匀后12000g离心5min，倾去上清液，室温凉干；(9)向DNA沉淀中加200μl TE缓冲液，-20℃保存备用。
1.3.2 DNA纯度和浓度的测定 取10μl TE溶解的DNA溶于2500μl双蒸水中，用国产UV-754分光光度计测260nm和280nm吸光值，计算OD值和提取DNA的浓度和纯度。
1.3.3 统计学处理 对三组样本的得率进行统计学处理，各组间检测数据均由均数±标准差表示；组间均值的比较用单一因素方差分析（ANOVA）处理。
2 结果
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的DNA样品浓度和纯度检测结果分别见表1、表2和表3。
表1 各样本水浴2.5h提取DNA的各项数据　略
表2 各样本水浴5h提取DNA的各项数据　略
表3 各样本水浴7.5h提取DNA的各项数据　略
对三组样本的DNA得率进行比较和统计学分析结果见表4。
表4 不同水浴时间酚、氯仿提取DNA得率比较 （略）
结果显示，用酚、氯仿提取肝脏DNA，随着水浴时间的延长（2.5～7.5h之间），DNA提取得率提高。Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅱ组与Ⅲ组、Ⅰ组与Ⅲ组间所提DNA得率的比较，各组间均 差异有显著性。
3 讨论
本研究采用组织DNA的酚-氯仿提取方法，在一定时间范围内（2.5～7.5h），改变水浴时间，随着水浴时间的延长，得到较多的DNA，可以更好地满足进一步实验的需要。对实验结果分析后发现，在酚-氯仿提取组织DNA的过程中，延长水浴时间后，在细胞裂解液、蛋白酶K和SDS的充分作用下，肝细胞裂解更充分，更多DNA从细胞中释放出来，提高了DNA得率。据文献报道，采用酚-氯仿提取石蜡组织DNA，水浴时间高达16h以上，说明水浴对于DNA提取非常重要。从理论上讲通过延长水浴时间至7.5h可获得更多的组织DNA，但是延长水浴时间同时会增加DNA降解率。因此，将水浴时间定为多少可提取质量好、最大量的DNA尚需进一步的实验研究。
本实验的优点： （1）当组织量少又需获得较大量的DNA时，采用此方法简便易行。 （2）方便计算所提DNA的纯度和浓度。国内实验室一般采用国产紫外分光光度计测量所提取DNA在260nm和280nm处的吸光值。计算出其所提DNA的浓度和纯度。本实验采用国产UV-754紫外分光光度计测量DNA在260nm和280nm处的吸光值，该仪器在DNA样本透射比在20％～80％时其测量值较准确（透射比与DNA的浓度成反比）。提取的DNA得率高时，可以将其稀释至一定比例，在该仪器的敏感范围内准确测其260nm和280nm处的吸光值，从而计算其浓度、得率和纯度。提取的DNA得率低时，其透射比不在该仪器的敏感范围内，故不能准确测其260nm和280nm处的吸光值，从而不能准确计算其浓度、得率和纯度。笔者曾用试剂盒提取组织DNA，由于提取的DNA得率低而无法准确计算样本的浓度、得率和纯度。在采用酚-氯仿法提取组织DNA过程中，通过延长水浴时间可以很好地解决此困扰。（3）使PCR的反应更加严密。通常提取DNA量少而无法计算其浓度和纯度时，在进行PCR实验中往往采取将模板稀释10倍、50倍、100倍等方法，并对每个样本都进行模板量的摸索，在这个过程中浪费了大量的时间、物力和财力。提高DNA的提取量，准确计算其浓度和纯度，在进行PCR实验中将模板DNA的使用量量化，可以减少预实验次数，使PCR的反应更加严密准确。