医药学论文：重组CD200基因在COS

【摘要】 目的 研究构建于重组真核表达载体pcDNA3-CD200上的CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达。方法 体外扩增并酶切鉴定pcDNA3-CD200质粒；常规方法培养COS-7细胞；用电转染基因法将pcDNA3-CD200质粒转入COS-7细胞中，用流式细胞术（FCM）检测转染细胞CD200表达。结果 转染COS-7细胞后72h，CD200基因表达阳性的细胞计数率为44.5%。结论 成功的利用电转染基因法将重组真核表达载体pcDNA3-CD200转染到COS-7细胞中，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为进一步研究CD200的生物学活性以及信号传导奠定了基础。

 

【关键词】 CD200;COS-7细胞; 电转染; 流式细胞术

 

【Abstract】 Objective The transient expression of CD200 gene which was constructed to the recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3-CD200 was tested. Methods pcDNA3-CD200 plasmid was amplified and tested by an enzyme cutting technique. COS-7 cell was cultured in vitro and transferred with pcDNA3-CD200 by electrotransfer media method. The expression of CD200 was detected by flow cytometry. Results After the COS-7 cell was transferred for 72 hours,the expressing rate was recorded for 44.5%. Conclusion The recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3-CD200 was transferred into COS-7 cells successfully by electrotransfer media method. After being transferred to COS-7 cells, the CD200 protein was expressed, which lays a foundation for further studying biological activity and signal transduction of CD200.

 

【Key words】 CD200; COS-7 cells; electro transfer; flow cytometry

 

CD200是Ⅰ型膜糖蛋白，为免疫球蛋白超家族的新成员，广泛表达在人类胸腺细胞、B细胞、激活的T细胞、滤泡状树突细胞、神经元及血管内皮上［1］。近年来的研究发现，CD200和其受体（CD200R）的交互作用可以下调髓样细胞的活性，从而减轻多种自身免疫性疾病症状、延长同种或异种移植物存活时间、抑制前炎症因子引起的流产、诱导免疫耐受等［2～4］。为深入探讨该基因的功能，本实验应用电转染技术，介导目的基因CD200转染到COS-7细胞中，建立该基因的瞬时表达系统，为进一步在体外研究该分子对髓样细胞的调控机制打下了实验基础。

 

1 材料与方法

 

1.1 质粒和细胞株 pcDNA3-CD200质粒由笔者构建［5］ ；COS-7细胞株由吉林大学中日联谊医院中心实验室常规培养。

 

1.2 试剂及仪器 DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自天津TBD公司； FITC标记的鼠抗人CD200单克隆抗体购自Santa Cruz公司；质粒提取试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、DL2000 Marker和λDNA HindⅢ digest Marker均购自大连Takara公司，化学试剂均为国产 分析纯。仪器：CO2培养箱系日本平泽公司生产；MT-2型倒置显微镜系日本Olympus公司生产；电转染仪系Eppendorf公 司生产；流式细胞仪(ELITE-Ⅱ)系美国Coulter生 产。

 

1.3 重组质粒的制备及酶切鉴定 质粒经扩增后，参照质粒提取试剂盒说明提取、纯化质粒，经EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切鉴定，并用紫外分光光度计测定DNA含量和纯度。

 

1.4 电穿孔法转染COS-7细胞 基因转染设立pcDNA3-CD200重组质粒组、pcDNA3空质粒组及对照组，采用电穿孔方法转染［6］。COS-7细胞用含10% FCS的DMEM培养于100ml的细胞培养瓶，约75%长满，0.25% 胰酶加EDTA消化后离心收集细胞，用少量PBS液重悬，调整每组细胞数至1×106个/ml。分别取20μg的pcDNA3-CD200重组质粒、pcDNA3质粒加入相应的细胞悬液中混匀，各组均分别移入0.2cm 的电穿孔杯中，冰浴10min后放入电穿孔仪的正负极之间。电穿孔参数为：真核、使用脉冲的电压110V,间隔时间20ms,电阻∞，穿孔1次。电击后将穿孔杯继续冰浴5min，移入已含10% FCS的DMEM完全培养液的24孔板，37℃ 5%CO2孵箱培养。

 

1.5 流式细胞检测转染效果 72h后用PBS调整各组细胞数为1×106/ml，清洗2次后加入90μl PBS、10μl FITC标记的鼠抗人CD200抗体，充分混匀，避光4℃ 孵育30min后，每组用PBS重悬混匀离心弃上清，各加入500μl PBS，用30目滤网过滤，上机检测CD200的表达。