医药学论文：核酸疫苗与寄生虫核酸疫苗的研究进展

关键词： 核酸疫苗；寄生虫病
　　【摘　要】　本文较为详细地叙述了核酸疫苗的优点、作用机理，简略介绍了核酸疫苗在疟疾、血吸虫病、囊虫病和利什曼原虫病的应用与研究进展。

　　【Abstract】　Many advantages and principles of nucleic acid vaccine were reviewed in detail. The progress of its application and studies on malaria, schistosomiasis, cysticercosis and leishmaniasis were mentioned briefly.

　　【Key words】　nucleic acid vaccine；parasitosis

　　核酸疫苗就是将编码某种特异抗原的外源基因克隆到真核表达质粒上，然后把该重组质粒接种于机体，使这一外源基因在宿主体内表达，产生抗原刺激机体免疫系统，诱导特异性免疫反应。核酸疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程重组蛋白疫苗之后的第3代疫苗。1994年5月世界卫生组织全球疫苗和免疫规化等三个机构在日内瓦联合召开核酸疫苗会议,与会者充分肯定了核酸疫苗的潜在应用价值。核酸疫苗具有许多突出的优点：①能表达天然蛋白抗原，形成正确的折叠和翻译后糖基化等修饰,递呈给宿主免疫系统与自然感染过程相似，更接近天然分子形式，包括构型相关位点，因而能诱导更有效的免疫应答。②可诱导出全方位免疫，包括细胞免疫和体液免疫，核酸疫苗免疫后，可检测出较高滴度的特异性抗体和CTL反应。③生产简便、成本低廉、稳定性好且贮存方便，核酸疫苗只涉及到基因方面操作，既不象第1代减毒活疫苗那样需要放射线的防护设施，也不象第2代蛋白/多肽疫苗那样需要细胞培养、蛋白纯化等复杂过程。④使用安全，没有感染病原的危险，核酸疫苗仅仅是病原体某种抗原的基因片段，而不是整个病原体的基因，且利用质粒作载体，不涉及感染性因子。⑤免疫具有持续性，一次接种可获得长期免疫力，避免了灭活疫苗、重组亚单位疫苗等需多次加强免疫的繁琐。⑥同种异株的交叉保护作用，采用同种不同株之间的保守DNA序列作核酸疫苗，可以使其免疫作用突破地理株的限制，这在甲型流感病毒中已得到证实［1］。 因此，核酸疫苗已在细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病预防中显示出巨大的潜力。实验证明，DNA疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效力［2，3］ 。核酸疫苗的研究正在成为一个新的发展方向。本文将着重介绍核酸疫苗的机理和在寄生虫病预防中的应用。

　　1　核酸疫苗的作用机理

　　1990年由Wolff等首先提出裸露DNA技术，他们试图用化学方法促使小鼠的肌细胞吸收质粒DNA以产生新的蛋白质，设置的对照组在注射DNA时未加任何化学试剂。出人意料的是对照组动物肌细胞吸收了这种裸露质粒DNA并高水平地表达了外源蛋白质［4］。1991年Williams等发现注入基因在体内表达的蛋白质可诱导免疫应答［5］。 1992年Tang等的实验证实了Williams等的发现［6］。1993年Ulmer等证实小鼠肌肉注射编码甲型流感病毒核蛋白的重组质粒后，可有效地保护小鼠抗不同亚型流感病毒的攻击［7］。随后又有大量动物实验结果说明在合适的条件下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能引起体液免疫。目前使用的有质粒DNA和mRNA两种表达载体。利用mRNA作疫苗可以解决DNA疫苗相关的一些安全性问题。因为mRNA存在时间较短，不会整合到染色体DNA中去，因而不会引起插入突变。已证明mRNA直接注入小鼠骨骼肌在体内导致报道基因的短暂表达［4］。Martinon等将编码甲型流感病毒NP的mRNA用脂质体包封后直接经皮下和静脉内注入体内，有效地激发了抗病毒特异性的细胞毒性T细胞效应，而且mRNA翻译产生的NP蛋白能根据相应的MHC I型分子被加工成不同的抗原多肽［8］。应当强调的是，mRNA并不能代替DNA疫苗，它不具备DNA的所有优点。其表达短暂而不能诱导长期的免疫力。另外，mRNA不如DNA稳定，其生产、贮存、运输所需费用都比DNA高。而质粒DNA性质较稳定，易于提取和保存，在体内表达时间长并可诱发较强的免疫应答，故更常用。与灭活疫苗、减毒活疫苗和重组基因工程疫苗不同，常用核酸疫苗的化学性质为双链环状DNA。对于其免疫机理，目前还不能完全诠释，只有根据实验资料推测与如下几方面有关。

　　1.1　核酸疫苗在骨骼肌细胞表达的外源抗原由抗原提呈细胞（APC）提呈　注射核酸疫苗后三天即可通过免疫组化方法检测到肌细胞表达的外源蛋白质抗原［9］，但肌细胞并不能表达激活T细胞所必需的第二信号-B7［10］，不能进行抗原提呈。动物实验结果表明，核酸疫苗在嵌合体小鼠诱导CTL应答受供骨髓小鼠MHC限制，嵌合体小鼠的骨骼肌细胞不能提呈抗原，只有供者骨髓细胞来源的APC才能提呈抗原［11］。对严重联合免疫缺陷BALB/c小鼠分别肌注HIV、HSV核酸疫苗，三周后移植CB6F1小鼠脾细胞和骨髓细胞，小鼠能产生H-2b和H-2d限制性CTL，证明骨骼肌细胞来源的抗原能被CB6F1小鼠骨髓细胞中的APC吞噬、加工、活化CTL前体细胞［12］。

　　1.2　核酸疫苗直接转染APC　以任何途径（皮肤、粘膜、肌肉等）接种核酸疫苗，都可能直接转染专业APC，如巨噬细胞、树突状细胞。核酸疫苗在APC内表达的蛋白质抗原作为"内源性抗原"，经胞浆内的蛋白酶降解成8～10个氨基酸组成的肽，被内质网膜上的抗原肽转运结构转入内质网腔，与MHCI类分子形成聚合体，经高尔基体到达APC膜表面，被T细胞的受体识别，这是诱导CTL应答最有效的途径。APC在肌肉组织分布较少，但极少量APC被转染即能诱导免疫应答，不到200个树突状细胞被核酸疫苗转染即可诱导抗体产生和CTL应答［13］。

　　1.3　核酸质粒的免疫佐剂功能　近年发现细菌DNA本身也是一种免疫佐剂，可有效地激活免疫效应细胞。介导这一作用是一类具有特征性的短核苷酸序列，被称作免疫刺激DNA序列（Immuno-stimulatory DNA sequence,ISS）［14，15］。对DNA 的分段研究分离出一些引起NK细胞激活的ISS，这些序列绝大部分是由胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸为基元的寡聚体，其碱基排列大多遵循一种规律，这种特征性序列则称作为ISS［16］。ISS的发现以及对其生物学功能研究的不断深入，扩展了人们对DNA生物学功能的新认识。同时，对ISS的研究也有望提供一种高效、低毒、适用于人类的新型佐剂。研究发现氨苄青霉素抗性基因含两个ISS，而卡那抗性基因无此序列。将带氨苄青抗性基因的半乳糖苷酶表达质粒pACB-Z或pACS-Z皮内注射小鼠能诱导强的体液和CTL免疫应答，以卡那抗性基因置换氨苄青抗性基因构成pKCB-Z进行免疫所诱导的抗体效价明显降低，不能测及CTL应答。将pUC19、pACB、pKISS-CB-Z和含ISS的寡核苷酸分别转染人外周血单核细胞，可检测到干扰素， 干扰素、IL-12的表达增高三倍，而pKCB或无ISS的寡核苷酸则无此效应［15］。由于DNA疫苗可在机体内较长时间表达，局部形成抗原库，类似弗氏完全佐剂中矿物油存留抗原作用，同时质粒骨架中的ISS还可选择性地刺激Th1应答。因此，用于DNA免疫目的的质粒DNA(pDNA)从概念上可分为两个部分：①转录部分，指导相应的抗原蛋白在体内表达；②佐剂部分，辅助机体对抗原产生免疫应答。