医药学论文：反义核酸技术及其在寄生虫学中的应用进展

反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术[1-3]。它包括反义RNA、反义DNA和核酶(ribozymes)三大技术。反义核酶作为一种基因下向调节作用因子，在抑制一些有害基因的表达和失控基因的过度表达上发挥着重要作用。随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病的研究。本文拟就反义核酸技术的作用原理和特点作一简要概述，着重阐述其在寄生虫领域中的应用进展。

　　1　反义核酸的作用原理

　　反义核酸目前有三种来源：一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides，AON)，这是反义核酸最普遍的应用方式，包括未修饰AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修饰AON二类，其中以PSAON应用最广泛。ANO设计合成简单，只要其顺序与靶mRNA部分顺序互补即可，而对基因的读码框无要求；二是更具有实用价值的工人表达载体，包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体[3]，它是利用基因重组技术将靶基因序列反向持插入到载体的启动子和终止子之间，通过转录可源源不断产生反义RNA分子；三是天然存在的反义核酸分子，但目前分离纯化尚存在困难。

　　1.1　反义RNA和反义DNA

　　反义RNA是指能和mRNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段，反义DNA是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子。反义RNA和反义DNA主要是通过mRNA的翻译和基因DNA的转录而发挥作用[10]：1)抑制翻译。反义核酸一方面通过与靶mRNA结合形成空间位阻效应，阻止核糖体与mRNA结合，另一方面其与mRNA结合后激活内源性RNase或ribozyme，降解mRNA[3]；2)抑制转录。反义DNA与基因DNA双螺旋的调控区特异结合形成DNA三聚体(triplex),或与DNA编码区结合，终止正在转录的mRNA链延长[3]。此外，反义核酸还可抑制转录后mRNA的加工修饰，如5'端加帽、3'端加尾(poly a)、中间剪接和内部碱基甲基化等，并阻止成熟mRNA由细胞核向细胞浆内运输。

　　1.2　核酶

　　Cech等发现四膜虫核糖体RNA前体在成熟过程中，可精确地自我切除某些片段并重新连接，这种具有酶催化活性的RNA称之为核酶[11,12]。

　　核酶广泛存在于生物细胞中，有锤头状和发夹二种结构。酶活性中心由两个臂和中间的功能区组成[13]。两个臂序列高度保守，与靶RNA特异互补结合，相当于一种反义RNA，而功能区则可通过降解RNA的磷酸二酯键而分解消化靶RNA，而核酶本身在作用过程中并不消耗。核酶裂解分子依赖严格的空间结构形成，裂解部位总是位于靶RNA分子中GUX三联体(X：C、U、A)下游方向即3'端[12]。

　　核酶除天然存在外，也可人工合成。根据核酶的作用位点、靶mRNA周围的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工设计合成核酶的特异性序列。此外，利用基因工程将核酶的编码基因克隆在SP6或T7等启动子下游，通过转录合所需核酶。核酶能特异切割RNAA分子，使阻断基因表达，特别是阻断有害基因的表达成为可能。如果已知靶mRNA中GUX三联体的位置，可将核酶的编码基因插入反义表达载体的适当位置，这样转录所产生的含有核酶的反义RNA具有双重功能：一方面具有反义抑制作用，另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。核酶在抗肿瘤、抗病毒方面具有十分诱人的前景，第一个应用核酶进行艾滋病基因治疗的临床计划已获准，核酶作为一种遗传信息药物，在肿瘤基因治疗中必将日益受到重视。

　　2　反义核酸的作用特点

　　反义核酸作为基因治疗药物之一，与传统药物相比具有诸多优点。1)高度特异性：反义核酸药物通过特异的碱基互补配对作用于靶RNA或DNA，犹如"生物导弹"。2)高生物活性、丰富的信息量；反义核酸是一种携带特定遗传信息的信息体，碱基排列顺序可千变万化，不可穷尽。3)高效性：直接阻止疾病基因的转录和翻译。4)最优化的药物设计：反义核酸技术从本质上是应用基因的天然顺序信息，实际上是最合理的药物设计。5)低毒、安全：反义核酸尚未发现其有显著毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。

　　3　反义核酸技术在寄生虫学中的应用

　　反义核酸技术的飞速发展和成熟，使其逐渐渗透并应用到寄生虫学领域，丰富和发展了寄生虫病的基因治疗策略。反义核酸技术在抗寄生虫病研究的应用主要集中于原虫类，如疟原虫、锥虫和利什曼原虫等，而且反义核酸中又以AON方面的报道最多。下面着重就AON在寄生虫方面的研究应用作用一简要阐述。

　　3.1　疟原虫

　　疟原虫嘌呤核苷酸合成具有特殊性，即无从头合成途径，依靠补救合成途径利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷。疟原虫的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)和胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TS)结合形成双功能蛋白(DHFR-TS)，这对于维持疟原虫四氢叶酸水平和DNA合成极为重要[14]，此酶也是疟原虫脱氧胸苷酸生物合成唯一通路中必不可少的酶。抗疟药中的抗叶酸代谢药如乙胺嘧啶，就是通过竞争性抑制DHFR-TS来阻断虫体脱氧胸苷酸生物合成[15]。然而，随着恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)多药抗性株的出现和广为传播，疟疾的化疗面临重大挑战，促使人们寻求新的抗疟疗法。目前，DHFR-TS是AON抗疟作用首选靶基因。

　　生物大分子进入感染红细胞中的疟原虫，必需穿透三层膜，即红细胞膜、纳虫泡膜和虫体的胞质膜。研究表明，不能穿透红细胞膜和纳虫泡膜的大分子和葡聚糖、IgG2a抗体和蛋白A等，可经过纳虫微管(parasitophorous duct)进入虫体，虫体通过胞吞作用直接从细胞外摄入大分子物质[16]。因此，对于小分子的AON而言，作用于感染红细胞中的虫体完全成为可能，下述众多研究已充分证明了这一点。Rapaport等(1992)研究发现[17]，以DHFR-TS为靶21 nt PS AON能选择性地进入恶性疟原虫感染红细胞，对体外培养的氯喹敏感株和耐药株虫体具有同等的抑制效果，而未感染疟原虫的红细胞则完全为不摄入AON，因此这对应用反义核酸于抗疟治疗非常有利。

　　诸多研究表明，AON越长，对转译的抑制作用就越强；AON浓度越高，非特异性抑制作用越明显，在低浓度时则呈特异性抑制。Sartorius和Franklin(1991)以DHFR-TS的mRNA为靶合成系列AON，利用兔网织红细胞翻译系统，探讨AON对体外转译的抑制作用[18]。在DHFR翻译起始位点处合成了6条21－49nt不等长的AON，在TS编码区全成的30nt、39nt和49nt三条AON。当AON长度为30nt或更长时，呈明显转译抑制作用，抑制率可高达50％以上。其中，TS编码区的49nt aON(OTS49)抑制效果最高，当浓度在45μmlo/L时的抑制率几乎达90％，主要是因为OTS49与DHFR-TS靶mRNA结合抑制TS合成，这从翻译产物的分子量(55 kDa)要比天然DHFR-TS(71 kDa)小且无TS活性可看出。