医药学论文：孕激素和米非司酮对子宫内膜癌HHUA细胞的作用

【摘要】 目的 探讨孕激素和孕激素受体拮抗剂米非司酮对人子宫内膜癌HHUA细胞株的生长抑制作用及对其表达凋亡蛋白的影响。方法 体外培养人子宫内膜癌HHUA细胞，不同浓度孕激素和米非司酮分别作用于细胞72h，绘制细胞生长曲线计算半数有效浓度（IC50）后，分为对照组、孕激素组、米非司酮组、孕激素和米非司酮联合组，以各药物的IC50干预细胞48h后，用MTT法计算细胞抑制率，免疫组化S-P法测定各组细胞bcl-2和Fas蛋白表达的变化。结果 MTT实验表明，孕激素和米非司酮均能抑制子宫内膜癌细胞增殖。孕激素半数有效浓度为100.7537μmol/L；米非司酮的半数有效浓度为39.5534μmol/L，联合用药组抑制率显著高于单独用药组。孕激素和米非司酮联合可使bcl-2表达下降，Fas表达升高（P＜0.05）。结论 孕激素和米非司酮联合应用在子宫内膜癌HHUA细胞的抗增殖和干预bcl-2和Fas蛋白的表达方面有协同作用。
【关键词】 子宫内膜肿瘤；孕酮；米非司酮；肿瘤细胞；培养
Effects of progesterone and mifepristone on the human endometrial cancer cell line HHUA
【Abstract】 Objective To study the effects of progesterone and mifepristone on the growth inhibitions and apoptosis protein of human endometrial cancer cell line.Methods HHUA cells，treated by different concentrations of progesterone and mifepristone were examined for their growth inhibitions with methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） assay after 72 hours and got the inhibitory concentration 50%（IC50）. HHUA cells，treated by control，progesterone or mifepristone or progesterone combined mifepristone for 48 hours，were examined for their inhibitory rate with MTT and for their bcl-2 and Fas with immunohistochemistry assay.Results HHUA cells growth was inhibited by progesterone and mifepristone.IC50 of progesterone is 100.7537μmol/L；IC50 of mifepristone is 39.5534μmol/L.The inhibitory rate of progesterone combined with mifepristone was obviously stronger than that of progesterone and mifepristone. The expression of bcl-2 was decreased and Fas increased（P＜0.05）. Conclusion HHUA cells was treated by progesterone combined with mifepristone and synergistic effect was observed on the inhibitory growth and the expression of bcl-2 and Fas.
【Key words】 endometrial neoplasms；mifepristone；progesterone；tumor cells；culture
近20余年来，子宫内膜癌的发病率有上升趋势，且随着发病年龄的年轻化，保留生育能力的治疗方案已成为患者的迫切需求。激素治疗是年轻子宫内膜癌患者的主要保守治疗手段之一，研究显示［1］，年轻未育的内膜癌Ⅰ期患者，如果细胞分化好可以考虑保守治疗，同时严密监测有无复发，等待完成生育后再行手术治疗。目前子宫内膜癌激素治疗的主要药物有高效孕激素及三苯氧胺。有研究表明，孕激素受体拮抗剂米非司酮对多种肿瘤细胞具有抑制作用。本实验旨在探索孕激素和米非司酮二者联合对子宫内膜癌HHUA细胞的生长抑制作用，以及该方案对HHUA细胞株表达凋亡蛋白的影响，以期为临床治疗子宫内膜癌提供新方案。
1 材料与方法
1.1 子宫内膜癌细胞系 子宫内膜癌HHUA细胞是高分化子宫内膜腺癌细胞，其含有雌二醇受体和孕激素受体以及wt p53、p21等基因，由山东省立医院生殖中心惠赠。
1.2 主要试剂和仪器 黄体酮分析纯购自江苏省药物检验所。米非司酮纯品由北京第三制药厂提供。DMEM细胞培养液（Gibco），小牛血清（杭州四季青），四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司），96孔培养板（Costar公司），酶联免疫检测仪（SPECTRAMAX 250型德国生产）。鼠抗人bcl-2、Fas单克隆抗体均为北京中杉公司产品。
1.3 细胞的制备 HHUA细胞在含10％小牛血清的DMEM培养液中置37℃、5％CO2培养箱中培养，每4～5天传代，药品用无水乙醇溶解，并用含小牛血清的培养基稀释到所需浓度，使乙醇终浓度小于1％。
1.4 四甲基偶氮唑盐（MTT）比色实验
1.4.1 绘制细胞生长曲线 取对数生长期HHUA细胞制备成3×104个细胞/ml，混匀后加入96孔细胞培养板，每孔200μl，24h后观察细胞已贴壁，吸弃上清加入含药物的培养基，孕激素的剂量稀释为0、10、20、40、60、80、100、120、140、160μmol/L，米非司酮的剂量稀释为0、5、10、20、40、60、80、100、120μmol/L，空白对照组中加入相等体积不含药物的培养基，每组6个复孔，培养72h，加MTT溶液（5mg/m）20μl，继续孵育4h，吸弃上清，每孔加入150μlDMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解，选择490nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值，记录结果，按下列公式计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率。抑制率＝（AC-AT）/AC×100%。
AC为对照组吸光度值，AT为实验组吸光度值。以药物抑制百分率为纵坐标，药物浓度为横坐标，通过直线回归分别计算孕激素和米非司酮抑制50％肿瘤细胞时的有效浓度（IC50）（见图1），以IC50值作为干预细胞的药物浓度。
1.4.2 MTT法检验细胞增殖率 取对数生长期HHUA细胞制备成3×104个细胞/ml分别加入药物：对照组（加入与实验组等体积的培养液和溶解药物所用的等体积的无水乙醇）、P组（孕激素100.7537μmol/L）、RU486（米非司酮39.5534μmol/L）、P+RU486联合组（孕激素100.7537μmol/L＋米非司酮39.5534μmol/L）。每组6个复孔，培养48h后，MTT法检测细胞增殖率。
1.5 免疫组织化学法
1.5.1 将处于对数生长期的HHUA细胞制备成1×105个细胞/ml的细胞悬液，在每孔底面铺有洁净小玻片的24孔培养板中每孔加入1ml，24h后待细胞贴壁后加入药物：对照组、P组、RU486组、P+RU486联合组，每个浓度设双孔，培养箱中继续培养48h，PBS冲洗2遍，用丙酮固定细胞玻片5～10min，严格按免疫组化操作程序进行S-P法染色。
1.5.2 染色结果判断 阳性表达为棕黄色颗粒的出现，其中bcl-2定位于细胞浆，fas定位于细胞膜。按AB值法进行光镜分析，A表示显色深浅：0分无显色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕色；B表示每个高倍镜视野棕色细胞所占比例：1分棕色细胞＜1/3，2分棕色细胞1/3～2/3，3分棕色细胞＞2/3，共记数5个高倍镜视野。每例细胞阳性表达积分（A×B）分为四级："－"（阴性）积分为0分；"＋"（弱阳性）积分为1～2分；"＋＋"（阳性）积分3～4分；"＋＋＋"（强阳性）积分＞4分。
1.6 统计学分析 数据分析采用SPSS11.5统计软件，所有数据结果均用x±s表示，组间多个样本均数间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 绘制细胞生长曲线 两种药物对肿瘤细胞的抑制率均随着药物浓度的增加而变化，存在明显的量效关系，P对HHUA细胞生长抑制的IC50为100.7537μmol/L，RU486的IC50为39.5534μmol/L（图1）。