医药学论文：古代人类牙齿DNA的提取和扩增条件研究

【摘要】 目的 以河南洛阳二里头遗址出土的距今3000多年的夏代人牙齿为标本，从口腔医学的角度分析牙齿DNA提取的污染控制，并进行PCR扩增条件的比较研究。方法 对古代人类牙齿样本进行去污处理，放入液氮研磨机中打磨成牙粉，使用GENECLEAN○R Kit for Ancient DNA 试剂盒从牙粉中提取DNA分子；利用不同条件的5种PCR反应体系扩增古DNA。结果 从牙齿样本中抽提出古代DNA片段A；在PCR扩增中，加入适量的小牛血清蛋白BSA有助于消除古代样本中PCR抑制物的作用；适合的Mg2+浓度则有助于增加DNA聚合酶的活性，减少非特异性扩增。结论 古DNA试剂盒是一种有效的古DNA抽提方法；小牛血清蛋白BSA和Mg2+浓度对PCR反应存在影响。
【关键词】 古代人类牙齿；DNA；提取；扩增；小牛血清蛋白；Mg2+
A study of extraction DNA from ancient teeth and the influences of amplifying conditions
【Abstract】 Objective To extract DNA from human ancient teeth remains more than 3000-years-old excavated from Erlitou ruin in Henan province，and analyze the pollution control from dental aspect and study the influences of different conditions of PCR.Methods The teeth were cleaned and grinded into powder by FREEZER/MILL6750. DNA was extracted with ancient DNA extraction kit and amplified under 5 different polymerase chain reaction conditions.Results DNA was extracted from teeth powder；BSA helps to eliminate the effects of inhibitions；proper density of Mg2+ helps to increase the activity of TaqE and avoid the amplifying errors.Conclusion Ancient DNA extraction kit is a effective way to extract ancient DNA；BSA and the density of Mg2+ have influences on the results of PCR.
【Key words】 ancient teeth；DNA；extraction；amplify；BSA；Mg2+
牙齿是人体中最坚硬的组织，往往可以历经几千甚至上万年而不发生腐败和解体。DNA分子的片段可以在生物体死亡之后的很长时间内保存。利用现代分子生物学的手段提取留存在古代人类和动植物样本中的DNA分子，可以直接分析古代样本中的遗传信息。本研究作为国家自然科学基金资助项目，从河南洛阳二里头遗址出土的距今3000多年的夏代人牙齿标本中提取线粒体DNA序列，从口腔医学的角度分析牙齿DNA污染的控制，并对古代DNA进行PCR扩增条件的摸索和比较。
1 材料与方法
1.1 研究对象 本研究所采用的样本为中国社会科学院考古研究所二里头工作队提供的从河南洛阳二里头遗址出土的夏代人类牙齿三枚，都来自于同一个体。
本研究样本选择标准为：(1)非游离牙齿；(2)牙体完整，无明显裂纹；(3)牙周状况良好，无明显牙槽骨吸收；(4)牙齿所在牙槽骨保存状况良好；(5)同一个体具有多颗牙齿符合条件。(注：牙周病的判断参照毛燮均教授1959年研究安阳殷墟人骨牙周病的诊断标准，以牙槽骨的明显病变为标准，牙槽骨吸收达牙根的1/2者，才视为此病［1］。)
本研究的牙齿样本取自保存状况良好的下颌骨上。
1.2 研究方法
1.2.1 样本处理 　　在从下颌骨上取下用于实验的牙齿样本时，要充分考虑到古代骨骼标本比较干燥，脆性大。为防止牙根折断，暴露牙髓腔，造成污染，取牙时要十分小心。取下单根牙时，做唇舌向轻微晃动牙齿并稍加旋转。取下多根牙时，只可轻微晃动牙齿不可旋转，若单纯晃动无法将牙齿取下，则磨除部分牙槽骨以去除骨阻力以保证牙齿完整脱出。
选择完整取出的牙齿进行去除表面DNA污染的处理：1N的盐酸浸泡5～10min，无菌双蒸水清洗，再用无水乙醇清洗，晾干；用紫外线照射牙样各侧面，每个侧面15min。将牙齿放入液氮研磨机FREEZER/MILL6750中打磨成粉。
1.2.2 提取DNA［2，3］ 使用GENECLEAN○R Kit for Ancient DNA 试剂盒(所有试剂为无核酸污染试剂)提取存在于牙粉中的DNA，用于扩增目的片段。每次抽提均设空白对照。
1.2.3 古代DNA的扩增 　　抽提得到的是核DNA和线粒体DNA的混合物。本研究的目的片段位于线粒体DNA的高可变一区。这一区域是非编码区，具有突变速度快，无内含子，插入缺失较少，无重组现象等特点，因此它被广泛采用作为古DNA研究的目标片段。本研究采用吉林大学生命科学院古DNA实验室设计的引物来扩增古代个体的线粒体DNA高可变一区的DNA片段，引物设计严格遵循引物设计的原则［4］。
DNA片段的扩增按Handt［5］的方法进行，操作过程在台式PCR防污染超净台中完成。PCR扩增反应采用12.5 l体系。为探索本研究样本的最佳PCR条件，研究小牛血清蛋白BSA和Mg2+浓度对扩增结果的影响，分别设计以下几种不同条件的PCR反应体系。见表1～5。