医药学论文：斑点杂交条件的建立及优化

【摘要】 目的 进行斑点杂交条件的建立及优化。方法 采用带正电荷的尼龙膜对斑点杂交的每一步骤进行优化，包括预杂交液，杂交液，洗涤和封闭液等及各步反应时间，并采用最终确立的条件检测糖基转移酶基因多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（pp-GalNAcT2）在K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株中的差异表达以验证膜杂交条件的可行性。结果 建立并优化了膜斑点杂交的条件，本底清晰，结果可靠。结论 建立的斑点杂交技术经济简便，切实可行。

【关键词】 斑点杂交；糖基转移酶；基因

The establishment and optimization of the dot blot prerequisite

【Abstract】 Objective To establish and optimize the dot blot technique.Methods We used the positively charged nylon membranes to optimize experiments for the dot blot including prehybridization solution， hybridization solution， washing buffer， blocking solution et al， and the times of every step. In order to validate its feasibility ， we analyzed the expression of ppGalNAc-T2 in different tumor cell lines by dot blot assay using the established hybridization system.Results We established and optimized the dot blot technique which had reliable results and low background.Conclusion The established dot blot technique is practicable and economical.

【Key words】 dot blot；glycosyltransferase；gene

基因的表达分析研究是分子生物学实验中较为常用的手段，主要有Northern blot 和斑点杂交(dot blot)等，因斑点杂交无需转膜，且DNA或RNA相对固定在一定的区域内，实验要求相对简单，因此斑点杂交更易为实验者所接受。目前一般均用商品化的试剂盒，但其价格昂贵，不是一般实验室所能普及，因此我们采用自配的试剂建立并优化了一套斑点杂交方法，无需特殊设备，经济简便，结果可靠。

1 材料与方法

1.1 多肽 N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（UDP-GalNAc:polypeptide N-acetyl galactosaminyl transferases 2，pp-GalNAcT2 EC 2.4.1.41）基因的获得。取pp-GalNAcT2克隆载体转染DH5α工程菌，筛选白色阳性克隆，抽取质粒，用M13正向、反向引物进行克隆PCR，M13 Forward 5′-GTAAAACGACGGCCAG－3′，M13 Reverse 5′－CAGGAAACAGCTATGAC－3′，电泳鉴定结果，可见约1200bp左右的条带。即获得相应的ppGalNAc-T2 cDNA片段。

1.2 采用T2特异的寡核苷酸探针进行斑点杂交法条件的建立及优化 探针序列如下：5′-GAAAGACCTTCATCACAGCAATGGAGAAGAA ，与ppGalNAc-T2 cDNA序列互补，长31bp。探针合成及探针5′端生物素标记均由上海生工生物工程公司完成。

1.2.1 斑点杂交操作程序 (1)以上述所得pp-GalNAcT2 的cDNA片段以1N NaOH和200mM的EDTA对比稀释，使成0.4N NaOH和10mM的EDTA的终浓度。(2)把稀释的pp-GalNAcT2 的cDNA片段在100℃变性5min，迅速置冰，冰冷10min以上。(3)膜（购自Amersco公司，带正电荷）用灭菌双蒸水浸泡10min，悬空晾干。(4)每点2μl把pp-GalNAcT2 的cDNA片段点在尼龙膜上，湿膜在紫外灯下照2min，取出让膜干燥。(5)杂交时以2×SSC浸膜5min，装入杂交袋，根据VECTOR NIT软件计算杂交温度的方法确定杂交温度为42℃。以每100cm2膜加20ml的预杂交液（50％的去离子甲酰胺，5×SSC，0.1% SDS，0.1% BSA，0.1% PVP，用pH7.5的PB调终体积）于42℃预杂交2～3h。(6)弃去预杂交液，在杂交液（50％的去离子甲酰胺，5×SSC，0.1% SDS，0.1% BSA，0.1% PVP，10％的硫酸葡聚糖，100μg/ml的剪切的鲑鱼精DNA，用水调终体积）中加入适量探针，以每100cm2膜加10ml的杂交液于42℃杂交过夜。(7)用足量洗涤液1（2×SSC，0.1% SDS）于42℃洗涤2次，再用洗涤液2（0.5×SSC，0.1% SDS）于55℃严谨洗涤2次。(8)用蒸馏水淋洗膜2～5min，然后用封闭液（不同浓度的BSA，0.1 M NaCl， 0.2%Triton-100，0.1M Tris，pH7.5）封闭。(9)倒出封闭液，加入用封闭液配制的适当比例稀释的卵白素-碱性磷酸酶（购自上海华舜生物工程有限公司），37℃孵育30min。(10)洗涤液3（0.1M Tris，0.15M NaCl，0.3%Tween20 pH 7.5）在37℃洗膜2次，检测缓冲液（0.1M Tris ， 0.1M NaCl， 0.1M MgCl2， pH 9.5）平衡，再以每10ml检测缓冲液加66μl NBT和11μl BCIP(均购自上海华舜生物工程有限公司)的显色液显色。(11)显色结束后以TE终止，用扫描仪获取图像。