医药学论文：中药治疗对大鼠坐骨神经损伤后mRNANGF表达的影响

【摘要】 目的 研究中药党参、丹参、黄芪、生地和复方神肌再生冲剂对大鼠坐骨神经损伤后神经再生的影响。方法 将大鼠分为党参组、丹参组、黄芪组、生地组、复方冲剂组和对照组，每组大鼠18只。麻醉下暴露右侧坐骨神经，在坐骨结节远侧0.8cm 处造成坐骨神经挤压伤，根据分组，术后给予不同的中药喂养大鼠。术后不同时间，取紧邻挤压伤部位远侧神经干，应用原位杂交的方法和图像分析处理系统定量测定神经组织中神经生长因子mRNA（mRNANGF）的表达。结果 丹参组和黄芪组大鼠坐骨神经挤压伤后第2周起，坐骨神经组织中mRNANGF表达明显增加，至伤后第4周达到高峰。党参治疗坐骨神经挤压伤，治疗后8周，mRNANGF表达较对照组明显增加，差异有显著性。在复方冲剂组，大鼠坐骨神经挤压伤后8周内，神经组织中mRNANGF表达始终处于高水平。各组大鼠坐骨神经mRNANGF表达与对照组之间的差异具有显著性（P＜0.05）。复方冲剂组大鼠坐骨神经mRNANGF表达与丹参和黄芪组之间的差异也具有显著性。结论 中药党参、丹参和黄芪可以促进挤压伤后大鼠坐骨神经mRNANGF表达；这种作用在组成复方冲剂后，表现得更为明显。
【关键词】 中药；坐骨神经损伤；神经生长因子mRNA
【Abstract】 Objective To decide which of Chinese herbs including Dangshen，Danshen，Huangqi and Shengdi has effect on improving the regeneration of peripheral nerve after nerve lesion and to study the mechanism of Chinese herb.Methods 108 SD rats(male，220～250g)were divided into six groups：Dangshen group，Danshen group，Huangqi group，Shengdi group，mixed group and control group.The rats were anaesthetized and the right sciatic nerves were crushed at the site 0.8cm distal to sciatic notch.After surgery the rats were fed with different Chinese herb according to different group.At various time after operation the rat were killed and the sciatic nerve stump just distal to the crush site were removed to evaluate the level of mRNANGF.mRNANGF was expressed by means of in situ hybridization and the level was determined by imaging analysis.Results In Danshen and Huangqi groups the levels of mRNANGF in sciatic nerve markedly increased at the second week after surgery.As compared with control group，the levels of mRNANGF in these two groups were greatly higher and the difference are statistically significant(P＜0.05).In mixed group the mRNANGF are all in high level compared with control group.At the eighth week after crushed the expression of mRNANGF in Dangshen group was higher than that of control group.Conclusion Chinese herbs including Danshen，Huangqi，Dangshen and mixed herbs can increase the expression of mRNANGF of rat sciatic nerve and improve the regeneration of sciatic nerve after nerve crushed.
【Key words】 Chinese herb；sciatic nerve injury；nerve growth factor mRNA
复方神肌再生冲剂对神经再生的促进作用已经被实验研究初步证实［1，2］。为了研究中药复方神肌再生冲剂及其组成成分对神经再生的影响，我们曾应用免疫组织化学的方法检测中药治疗后损伤的大鼠坐骨神经组织NGF蛋白表达［3］。随着分子生物学技术的飞跃发展，运用先进的实验手段，检测神经生长因子mRNA（mRNANGF）在神经组织中的表达来判断神经再生，其敏感度比检测NGF的方法要高得多。我们应用原位分子杂交的方法，研究复方神肌再生冲剂治疗大鼠坐骨神经损伤后神经生长因子（NGF）mRNA（mRNANGF）的变化，确定中药复方神肌再生冲剂中对神经再生有促进作用的单味中药。
1 材料与方法
1.1 动物选择及分组 SD大鼠，健康，雄性，体重230～250g，SPF级。由复旦大学医学院实验动物部提供。实验组90只大鼠分为5个处理组，分别为党参组、丹参组、黄芪组、生地组和复方冲剂组。每处理组18只大鼠再按术后取材时间分为术后2周、4周和8周3个时间组，每时间组6只。对照组30只大鼠分为5个时间组，分别为术后2天、1周、2周、4周和8周，每时间组6只大鼠。
1.2 动物模型制作 1%硫喷妥钠腹腔注射麻醉。局部脱毛，消毒。取右侧为手术侧。沿右侧臀大肌纤维方向做右臀及大腿上部皮肤切口，分开臀肌显露坐骨神经。于坐骨结节远侧0.8cm，坐骨神经分出支配大腿肌肉的分支之近侧，用带卡扣的无齿显微持针器夹住坐骨神经，合拢卡扣30s，造成神经挤压伤（crush）［4］。在损伤部位用11-0的无损伤缝线固定于神经外膜作为标记，伤口内置适量青霉素粉剂，关闭切口。
术后将大鼠分笼饲养，每笼3只。常规供给大鼠专用饲料和饮用水，室内20℃恒温。根据实验分组，每日给予相应的中药汤剂2ml灌胃。对照组大鼠术后给等量生理盐水灌胃。按分组要求，术后取紧邻挤压伤部位远侧坐骨神经干0.6cm，迅速置入4%多聚甲醛溶液固定。另取正常大鼠6只，取其右侧坐骨神经相应部位神经干，作为正常神经标本，用以检测正常神经mRNANGF。标本经4%多聚甲醛溶液固定24h后，脱水，石蜡包埋。常规石蜡切片，厚度为4μm。载玻片需要经过高温灭活RNA酶，APES镀膜。切片置4℃冰箱保存。
1.3 原位分子杂交实验方法［5］及步骤 NGF型原位杂交检测试剂盒（NGF ISH Detection Kit)由武汉博士德生物工程有限公司提供。核苷酸探针序列如下：
5′-GCTGTGATCAGAGTGTAGAACAACATGGAC-3′
5′-CCACACGCTGACACTGTCACACACCGAGAA-3′
5′-TATCCGGATAAACCGCCAGGCAGCCTGCTT-3′
参照试剂盒的基本步骤，根据反复预实验进行修改。每次实验均设立阴性对照片（在阴性对照片的组织上不加探针杂交液而代之以0.05M PBS缓冲液）。（1）脱蜡至水。（2）3%H2O2（目的：灭活内源性过氧化物酶；用0.02%DEPC水配制）37℃，10min。（3）暴露核苷酸片段（消化）：①胃蛋白酶2滴+3%柠檬酸1ml，混匀，预热；②将新鲜稀释的胃蛋白酶滴加在切片的组织上；③37℃，30min；④0.5M PBS液洗5min×3次。（4）杂交：①将切片上每块组织加上约10μl的寡核苷酸探针杂交液；②用适当大小的Parafilm(腊膜）覆盖组织；③37℃，过夜（15h左右）；④阴性对照片加0.5M PBS液10μl。（5）杂交后洗涤：2×SSC洗5min×3次。（6）稳定杂交探针：①将杂交探针稳定液A和杂交探针稳定液B按1∶19的比例混合；②将探针稳定液A、B混合后加在切片的组织上；③37℃，4h。（7）稳定后洗涤：2×SSC洗5min×3次。（8）滴加封闭液：①将封闭液加在组织上，37℃，20min；②甩去多余的封闭液。（9）兔抗地高辛：①37℃，1h；②0.5M PBS液洗2min×3次。（10）生物素化羊抗兔IgG：①将浓缩的生物素化羊抗兔IgG用0.5M PBS稀释1倍；②37℃，25min；③0.5M PBS液洗2min×3次。（11）SABC-POD：①将稀释的SABC滴加在组织上，37℃，25min；②0.5M PBS液洗2min×4次。（12）DAB显色：显色时间：20min，充分水洗。（13）根据情况，选用苏木素复染（一般不复染），10s，充分水洗。（14）37℃烤干，中性树胶封片。（15）观察结果：阳性信号呈棕黄色；阴性对照片上无棕黄色阳性信号出现。在复染的组织片上，可以显示神经纤维的基本结构。棕黄色的阳性信号位于神经纤维的周边，相当于神经纤维的髓鞘部位。
1.4 图像分析 应用Axioplan2图像处理系统（Carl Zeiss公司，德国）对原位杂交的切片进行分析。每个实验动物取切片6张，每组6个动物共取切片36张，将各指标的36个数据求出均数和标准差，代表某一组动物某一指标。在放大400倍高倍视野下，进行分析、记录并计算以下指标：（1）神经纤维的总面积（μm2）。（2）阳性信号面积（μm2）。（3）阳性信号面积/神经纤维总面积（%，简称"阳性信号面积百分比"）。（4）阳性信号的平均判断度。（5）平均灰度指数（average of grey index)：阳性信号面积百分比与平均灰度的乘积。用公式表示为：
平均灰度指数=阳性信号面积百分比（%）×平均灰度
平均灰度指数从阳性信号面积占总面积的多少（%）和阳性信号的密度两个方面全面反映了阳性信号的强弱程度。应用平均灰度指数判断阳性信号的强弱，比单独应用阳性信号百分比或阳性信号平均灰度（密度）进行信号强弱的判断要准确得多。
2 结果
2.1 形态学观察 应用原位分子杂交，DAB显色，mRNANGF阳性信号在切片上呈散在的、棕黄色斑点状。在复染的切片上，神经的其他结构可以显示，阳性信号位于神经纤维鞘的部位；轴索和雪旺细胞核的部位则没有阳性信号。阳性信号的强弱与mRNANGF表达的量有关。
2.2 正常坐骨神经mRNANGF表达及损伤后表达的改变 （1）正常坐骨神经的mRNANGF表达：取6只正常大鼠右侧坐骨神经相应部位神经干，检测神经组织mRNANGF含量。图像分析结果：正常坐骨神经的mRNANGF表达量极低，平均灰度指数为141.27±35.43。（2）损伤后坐骨神经mRNANGF表达的变化：坐骨神经挤压伤后，神经组织mRNANGF的表达明显增高，见表1。