医药学论文：曾 浩

 幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)是慢性活动性胃炎的病原菌，是消化性溃疡的重要致病因子，并与胃癌和胃黏膜相关淋巴细胞淋巴瘤(MALT)的发生有密切关系。流行病学调查显示，全球大约有50%的人群感染Hp，且发展中国家的感染率普遍高于发达国家［1］。Hp的来源和其传播方式目前还不清楚，较为可能的传播方式有粪-口或口-口传播。近年研究发现，Hp在体内外各种不利因素的作用下可发生形态变异，由螺旋体(spiral form)转变为球形体(coccoid form)。该球形体是一种有活力但不能培养成活(viable but noculturable stage，VNC)的Hp形态变异体［2］，可能在幽门螺杆菌感染的传播途径及其相关性消化系统疾病的复发中发挥重要作用。本文根据近年来国内外的相关资料，就球形体的超微结构、遗传学特征、生化代谢、体外培养、动物模型等研究现状综述如下。
1 Hp球形体的诱变因素
体内外各种不利于Hp生长、繁殖的因素均可诱导Hp由螺旋体转变为球形体。这些因素包括：(1)氧浓度的改变：Hp是一种专性微需氧菌，其生长环境最适宜的氧浓度为5%～8%。氧浓度过高(如在大气环境中)或过低(如在厌氧环境中)都可导致Hp由螺旋体向球形体转变。(2)培养时间的延长：随着培养时间的延长，培养基中的营养成分不断减少，毒性产物不断增加，螺旋体的Hp也逐渐转变为球形体。一般Hp培养5d后即可观察到球形体，2周后全部Hp均可转变为球形体。(3)药物的作用：多种亚抑菌浓度的抗生素，如氨苄西林、红霉素、甲硝唑等，以及质子泵抑制剂和铋盐都能诱导Hp从螺旋体转变为球形体，且抗生素对球形体的诱导作用比延期培养时更快。药物对球形体的诱导率依次为：β-内酰胺类和红霉素＞次枸橼酸铋＞次水杨酸铋＞胆盐。(4)氧化亚氮(一氧化氮，NO)的生成：体外研究发现NO能诱导Hp螺旋体快速转变为球形体，提示胃炎患者体内NO合酶活性的增高，可以导致胃内的Hp发生形态变异［3］。除上述四种诱变因素外，Hp生长环境中温度的变化或pH值的升高，也能诱导球形体的产生。
2 Hp球形体的超微结构
正常情况下，Hp表现为螺杆状，其长度为2～3μm，具有微绒毛和带鞘的鞭毛，菌体可借助它们游动。球形体直径一般只有0.8～1.0μm，形态上和内部结构有了一些变化。螺杆状菌的细胞壁和细胞膜在整个菌体上都紧贴在一起，细胞壁被细胞被膜覆盖，外部嗜锇物质比内层有较高的电子密度，菌体两端的超微结构也不同，在鞭毛端，细胞膜内表面下可以看到一些低电子密度物质。球形体的外层细胞壁和细胞膜通常是部分分开的，细胞质浓缩，电子密度高，特别是膜与壁分离较大时更是如此。细胞质和染色体有一些微小的退行性变，细胞壁嗜高锇物质的内外层和退化的细胞质有相同的电子密度［4］。扫描电镜证实球形体表面具有螺杆状菌没有的轻微褶皱［5］。悬浮于4℃水中7d的Hp，电镜显示大部分呈球形，有多根清晰的鞭毛，提示其仍有动力。球形体的亚细胞结构以及完整的双层膜结构都表明它是具有生命活性的［5］。在电镜下发现球形体细胞浆中具有多聚磷酸盐，多聚磷酸盐是细胞重复的能源及合成DNA和RNA的磷的来源，它的存在能使核酸延缓分解，细胞内的核酶和ATP水平可相互调节。螺旋体和球形体在细胞浆中都含有结晶状的铁包涵体［6］。铁是H.pylori必需的生长因子，病原体侵袭组织引起损伤的能力通常与铁消除力有关。Hp能与人乳铁蛋白结合，球形体结合乳铁蛋白的能力明显高于螺旋体［7］，提示球形体同样具有与哺乳动物细胞外基质粘连然后进一步定植、致病的能力。
3 Hp球形体的遗传学特征
She等［8］从消化性溃疡患者胃粘膜中分离出3株Hp，在甲硝唑作用下使其发生球形变，通过SDS-PAGE分析表明，Mr超过74 000的蛋白含量减少，通过Western免疫印迹法证实Mr 125 000处蛋白条带减弱，而在110 000和63 000处增强。PCP和PCR-SSCP的分析结果证明，尽管形态学上由螺旋体转变为球形体，但Hp重要的基因ureA、ureB、hapA、vacA、cagA仍然存在，hapA和vacA基因发生了点突变。因此，球形体有可能在适宜的环境条件下恢复毒力引起疾病复发。Sisto等［9］也证实，H.pylori培养31d后，球形体的RNA和DNA水平均下降，但仍具有ureA，cagA，vacA基因。PCR随机扩增多形性DNA图谱分析技术表明发生形态学转变的Hp具有相似的DNA谱带。这些研究提示，球形体的遗传学基础未发生改变，它有具有潜在的致病能力，Hp感染经抗生素治疗后的复发很可能与其球形变有关。Hp螺旋体向球形体转变的过程中，核糖体RNA发生了不随机断裂(nonrandom fragmentation)，这种机制对于细菌的生长、存活有着重要作用。近来研究认为，球形变时mRNA水平的下降与23SrRNA非随机断裂的方式有关，Hp螺旋体和球形体中毒力基因的表达受到不同方式的调控［10］。
生化代谢是细菌生命的基本特征、代谢的活跃程度与细菌的繁殖及生存能力密切相关。当Hp由螺旋体向球形体转换过程中，其ATP水平下降了约1000倍［11］。有研究显示Hp球形体可摄取5-溴脱氧核苷以合成DNA［12］，提示球形体具有代谢活性。酶学分析表明，Hp球形体及螺旋体的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶均为阳性，产生尿素酶的能力随着培养时间的延长而逐渐减弱。培养至120d时，在细菌抑制外界过氧化氢过程中有重要作用的过氧化氢酶仍为强阳性，球形体产生较强的过氧化氢酶有助于自身的生存。
Mizoguchi等［13］报道，球形体在4℃的PBS缓冲液和蒸馏水中保持100d仍具有合成蛋白的能力，保持在蒸馏水中20d后的球形体在酸性pH诱导下可表达几种蛋白，这可能和向螺旋体转化的生物学过程有一定的联系。
4 Hp球形体的体外培养
在不良条件下，如营养缺乏、有氧培养、延长培养时间、pH降低、升高温度或抗生素处理都可使Hp转变为球形体。球形体处在一种静止状态，虽有ATP活性，但很难生长，被广泛称为有基本呼吸活性但不能培养成活的状态(viable but noculturalbe stage，VNC)。Nilsson等［14］将肉汤培养基中的Hp用吖啶橙染色后观察其形态，发现培养2天后，96%Hp为螺杆状，培养4d后开始发生球形变，虽然未见繁殖，但这一时间足以使其在传播中发挥作用［15］。国内有学者在持续数月的液体培养中捕捉到3株球形体在室温下返祖［16］，提示环境中的异形Hp或治疗后变形Hp的回复可能是感染或复发的机制。各研究者报道的Hp在体外向球形体转化所需的培养时间以及转化率均有所不同，这可能是由于培养的条件差异所引起的。抗生素体外诱导可产生球形体，β-内酰胺类抗生素作用下的Hp转化率几乎为100%，这可能与该类抗生素主要影响细菌的细胞壁有关。Brenciaglia等［17］发现培养4周的Hp用抗生素作用24h后仍可继续存活，这种仍具生命活性的球形体有可能导致治疗后的复发和Hp在人群中的传播。
5 Hp球形体与细菌L型的区别
大多数细菌在体内外不利因素的作用下可以形成细胞壁缺陷的变异型，称为细菌L型。革兰阴性菌形成的细菌L型又称为原生质球(spheroplast)。国内有些学者根据Hp球形体的诱变因素(如抗生素、延期培养等)与细菌L型的形成条件相似，以及部分Hp球形体存在细胞壁缺陷的现象，认为Hp球形体就是Hp L型。但国外有研究发现Hp球形体与Hp原生质球之间存在很明显的差异。Sorberg等［18］在研究药物对Hp形态的影响时发现，Hp原生质球的主要诱导剂是β-内酰胺类抗生素，而Hp球形体则可由β-内酰胺类抗生素、红霉素和铋剂等多种药物诱导产生，并且阿莫西林诱导Hp螺旋体转变为原生质球的速度比红霉素和甲硝唑对Hp球形体的诱导速度快得多［19］。显微镜下，Hp原生质球比Hp球形体大。吖啶橙染色显示，Hp原生质球呈橙色，而延长红霉素和甲硝唑的作用时间能使Hp球形体由橙色转变为绿色。RNA含量多于DNA的细胞染成橙色，RNA大量降解而DNA正常的细胞染成绿色，说明随着药物作用时间的延长，Hp球形体的RNA含量逐渐减少，生存活力逐渐降低［19］。Hp原生质球在肉汤培养基中培养时能回复为螺旋体，但目前尚无研究证明Hp球形体培养时能回复为螺旋体［18］。由此可见，Hp球形体并不是细菌L型，而是一种特殊的Hp变异型。
6 Hp球形体感染的动物模型
消化系统结构的差异使人的Hp在动物体内难以感染，但Hp球形体感染的动物模型的研究已取得了一定进展。已有研究表明，球形Hp可在小鼠胃内定植、繁殖并引起胃炎［20］。提示球形体可能是慢性胃炎及消化性溃疡复发的主要原因及感染传播中的重要环节。通过胃癌的流行病学研究显示，Hp的阳性率极低，而球形体的检出率可高达77.2%［21］，表明Hp可以球形体的形式存在于胃癌变组织中，但它与胃癌之间的因果关系仍不清楚。近来有报道，从动物胃粘膜成功地培养出有致病性的球形体，但这种球形体与最初的螺杆菌的关系并不明确。Cellini等［20］将培养20d后球形变的Hp接种于Balb/c小鼠，2周后在其胃中检出了螺旋体，推测Hp的球形体具有活性，在体内可转变为螺杆菌。但Eaton等［22］同时将典型的Hp和球形体接种于悉生小猪，仅典型的Hp定植成功。这可能与球形体的粘附能力减弱，尿素酶活性下降等因素有关。
7 结语
自1983年发现Hp以来，作为世界范围内的传染病和头号致癌因子，已引起医学界和生物学界的广泛重视。深入研究Hp球形体的毒力和分子生物学特征，及其在疾病的感染和治疗后复发中所起的重要作用，进一步完善Hp球形体的动物模型，将有助于了解Hp的传播途径、感染致病的多样性机制以及抗生素治疗后的复发等问题，从而为临床提供防治依据。