医药学论文：哮喘小鼠骨髓树突状细胞的表型及共刺激分子研究

【摘要】 目的 探讨哮喘小鼠骨髓来源树突状细胞（DCs）的表型及共刺激分子在哮喘发病中的影响。方法 用卵清蛋白建立哮喘模型，利用rmGMCSF和rmIL-4体外诱导骨髓细胞分化为DCs，流式细胞仪检测DCs表面共刺激分子的表达，混合淋巴细胞反应检测DCs刺激同种异体的T淋巴细胞增殖的能力。结果 在两种细胞因子的作用下，从骨髓中可以诱导出大量的DCs；且均表达DCs的表面标志(33D1)。哮喘组DCs表达CD86分子的水平高于对照组，而CD40、CD80在两组之间没有差异；哮喘组与对照组DCs均能强烈刺激同种异体T淋巴细胞的增殖，哮喘组DCs的刺激能力明显强于对照组。结论 哮喘组DCs的抗原递呈能力增强，表明DCs在哮喘的发病中可能起着重要作用。
【关键词】 哮喘；树突状细胞；B7；CD40；混合淋巴细胞反应
The study of phenotypes and costimulatory molecules of dendritic cells in asthmatic mice
WU Jian-qing，SUN Yun，YIN Kai-sheng.The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Jiangsu 210029，China
【Abstract】 Objective The purpose of this study was to evaluate the effects of dendritic cells derived from bone marrow in the pathogenesis of asthma.Methods Murine model of ovalbumin (OVA)allergic asthma was established.DCs were developed by incubating bone marrow cells with rmIL-4 and granulocyte-macrophage colonystimulating factor. Phenotype was assessed with flow cytometry，and the antigenpresenting function was assessed with the mixed leukocyte reaction.Results DCs expressed DCs characteristic 33D1 can be developed from bone marrow cells by using rmIL-4 and rmGMCSF.The stimulating effect of the DCs on the proliferation of the lymphocytes was shown in asthmatic and control group，but the effect in asthmatic group was more intensive than control.DCs from asthmatic mice showed phenotypic differences in the expression of CD86，but there were no differences in the expression of CD80 and CD40 between asthmatic and controlled group.Conclusion This study suggests the antigenpresenting function of DCs in asthmatic group was increased and DCs may play an important role in the pathogenesis of asthma.
【Key words】 asthma;dendritic cells;B7;CD40;mixed leukocyte reaction
哮喘是一种以嗜酸性细胞(Eos)、T淋巴细胞和肥大细胞浸润、气道破坏及气道高反应(AHR)为特点，并且有多种炎性介质参与作用的慢性气道炎症性疾病。活化的CD4+T细胞（Th2）是主要的效应细胞。越来越多的研究提示共刺激分子B7.1(CD80)与B7.2（CD86）等在免疫反应中起重要作用［1，2］。树突状细胞（dendritic cells，DCs）是功能最强的专职抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APCs），是目前发现的唯一能在体外直接激活初始T细胞的APCs，因此DCs成为研究APCs与T细胞相互作用的桥梁和焦点。本研究旨在探讨哮喘小鼠骨髓树突状细胞表面分子的表达及其对淋巴细胞的刺激作用。
1 材料与方法
1.1 动物 BALB/C小鼠，4～6周，雄性，购自中国科学院上海实验动物中心。ICR小鼠，6~8周，雄性，购自江苏省实验动物中心。
1.2 细胞因子与抗体 重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）和重组小鼠白细胞介素-4（rmIL-4）（R＆D system）；FITC antiMouse CD86、FITC antiMouse CD80、FITC antiMouse CD40及AntiMouse DC Marker 33D1（eBioscience）；FITC Goat antiRat IgG（H+L）（北京中山生物公司）。
1.3 主要试剂 卵清蛋白（OVA，GradeⅡ）（Sigma）；RPMI1640培养基(含L-谷氨酸，不含NaHCO3)（GIBCO）；胎牛血清(FCS)（Hyclone）；丝裂霉素C（Kaowa Hakko Kogyo）；伴刀豆球蛋白(ConA)（Sigma）；CellTiter 96AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay(MTS)（Promega）。其他试剂为国产分析纯。
1.4 方法
1.4.1 小鼠哮喘模型的建立 参照文献［3］。20只小鼠随机分为两组，每组10只，在第1、8天腹腔注射OVA混悬液0.1ml［含OVA 10mg，Al(OH)3 20mg］，14天后以1%OVA超声雾化（S-888E型超声雾化器）吸入，每次30min，持续2周，直至出现呼吸急促，腹肌抽搐，烦躁不安等症状，为哮喘的阳性反应。正常对照组不做任何干预处理，正常饲养。
1.4.2 骨髓DCs的分离培养 参照文献方法［4］，略有改动。拉颈处死BALB/C小鼠，无菌剥离股骨和胫骨。用Hank's液冲出骨髓细胞。收集骨髓细胞悬液，用0.83%Tris-NH4Cl溶液裂解红细胞，加入完全培养液终止裂解。调细胞浓度为1×106/ml。接种于24孔培养板，每孔1ml。37℃，5%CO2的孵箱中培养，4h后轻轻摇动培养板，连同培养液一起弃去未贴壁的细胞，并加入含rmGMCSF（1000u/ml）和rmIL-4（500u/ml）的完全培养液继续培养。第3天弃去培养液和大部分悬浮的细胞，并补足细胞因子；隔日半量换液；第7天，用吸管轻轻吹打收集所有的悬浮细胞，即为体外培养扩增的小鼠骨髓来源的树突状细胞。
1.4.3 形态学观察 每日用相差显微镜观察细胞的生长和形态变化。
1.4.4 DCs表面分子的检测 收集培养至第7天的DCs，调细胞浓度为2×105/ml，分别加入1μl FITC标记的大鼠抗小鼠的CD86、CD80、CD40单克隆抗体和大鼠抗小鼠的DCs特异性标志--33D1，设立空白对照，4℃避光反应30min。在加入DCs特异性标志33D1的管中再加入2μl FITC标记的山羊抗大鼠IgG(H+L)，4℃避光反应30min。上流式细胞仪检测。
1.4.5 同种异体的混合淋巴细胞反应 将收集的DCs用完全培养液悬浮，加入终浓度为25μg/ml的丝裂霉素C，置37℃，5%CO2孵箱。调细胞浓度为4×104/100μl、2×104/100μl、1×104/100μl、4×103/100μl，加入96孔板，每个浓度3复孔。每孔再加入经尼龙毛柱分离的ICR小鼠的脾脏T细胞2×105/100μl，终体积为200μl。并设立ConA阳性对照、T细胞对照及空白对照。37℃，5%CO2孵箱继续培养96h。在培养结束前4h每孔加入20μl MTS溶液，继续培养4h。培养结束后用酶标仪读490nm时的吸光值，并计算刺激指数（SI）。SI=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（T细胞对照组OD值-空白对照组OD值），结果以3孔均值表示。
1.5 统计学方法 结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS10.0软件进行两样本组间的t检验，以P＜0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 骨髓DCs的体外培养生长 在rmGM-CSF和rmIL-4的诱导下，培养的第2天可以看到绝大多数细胞贴壁生长，出现点状的细胞集落，第3天轻轻摇动除去未贴壁的细胞并继续培养2天，可见细胞集落明显增多﹑增大（图1～3）。再继续培养可见细胞体积明显增大且形态不规则，有3～8个不等的突起，呈现特征性的星状、树突状，并且逐渐由贴壁变为悬浮，至第7天，细胞多悬浮但也有些稍微贴壁，但轻轻吹打即可脱壁，以此来收集细胞。在倒置显微镜下可以看到哮喘鼠骨髓来源的DC和对照组骨髓来源的DC均有大小不一的树突，但在镜下看不出二者树突数目有明显的差别。
2.2 流式细胞检测结果 FACS分析显示在哮喘鼠和正常对照鼠骨髓来源的DCs分子表面均有DC分化相关抗原CD80、CD40、CD86及小鼠DC特异的表面标志33D1的表达，如图4所示。但CD86分子的表达明显比正常对照鼠增高（51.60±8.73和36.11±3.51，P＜0.05），而其他CD分子在两组之间差异无显著性，如表1和图5所示。哮喘小鼠及正常对照小鼠骨髓DC都表达33D1分子，虽然表达不很高（由于IL-4的加入降低了它们的表达），但仍能证明培养出来的就是DCs。