医药学论文：应用LacZ报告系统研究白念珠菌HYR1基因的启动子活性

【摘要】 目的 应用LacZ基因报告系统明确白念珠菌相转换特异基因HYR1上游脯氨酸相关的启动子片段。方法 采用PCR、基因重组、酵母转化和报告基因测活，比较不同HYR1基因上游1800bp内不同片段的启动子活性。结果 -400~-200bp区域存在启动调控活性，其他区域未见相关的启动活性。结论 在HYR1基因上游-400~-200bp间存在与脯氨酸相关的基因调控元件，β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因系统可以用来研究白念珠菌基因调控活性。
【关键词】 白念珠菌；脯氨酸；基因
【Abstract】 Objective With PNG17(LacZ) as reporter gene to clarify the fractional activity of promoters concerned with proline from candida albicans yeast-hyphal regulation gene(HYR1).Methods Sequence between 1800bp upstream of the start of transcription and 43bp downstream of this site was investigated with serial 5'-deletion，the 5'-deletion promoters were recombinted with vector PNG17(LacZ) as reporter gene and the constructs were transiently transformed EGY48 yeast.Results -400～-200bp of candida albicans HYR1 gene had activity as promoter.Conclusion In the region of -400～-200bp of candida albicans HYR1 gene，there was regulatory element concerned with proline.PNG17(LacZ) as reporter gene is practicable.
【Key words】 candida albicans;proline;gene
白念珠菌是最重要的致病真菌，其基因组计划已经完成，越来越多的基因的功能和定位被阐明。然而由于缺乏合适的报告系统，相关基因，特别是一些重要基因的调控机制仍未明确，因此迫切需要找到恰当的报告基因。HYR1基因已被证明是白念珠菌菌相转换的特异基因［1］，脯氨酸是菌丝生长重要的诱导者，HYR1基因上游是否存在其顺式调控元件、它们的分布如何等这些问题尚无研究报道。本文应用含β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因的质粒PNG17与HYR1基因启动子（-1800~+43bp）组成的重组体，及酵母转化技术，逐段研究HYR1基因上游脯氨酸相关的启动子序列。
1 材料与方法
1.1 菌株和培养条件 白念珠菌为ATCC10261。白念珠菌在YEPD培养基中（2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母抽提物）培养至指数生长后期，按标准的酵母菌DNA抽提法分离染色体DNA以用作模板。
1.2 研究及对照片段的选择 对HYR1基因上游1.8kb左右的序列进行了研究，根据DNA ssist 2.0软件的分析结果，分段克隆了不等长的片段，它们分别是HYR1基因转录起始位点上游200bp、400bp、600bp，1000bp、1400bp、1800bp等，见图1。
1.3 报告系统的应用 载体PNG17是大肠杆菌、酵母菌的穿梭质粒，带有β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因，但基因上游没有启动元件。PNG17为Terrance G.Cooper教授（Department of Microbiology and Immunology，University of Tennessee）所赠，质粒图谱如图2。

 

 

 

 

1.4 重组体的构建 重组体中所含的启动子即是所要研究的白念珠菌菌相转换基因HYR1转录起始位点上游的各个大小不同的DNA片断。它们具有相同3'端，分别对应于HYR1基因上游-1800~+43bp，-1400~+43bp，-1000~+43bp，-600~+43bp，-400~+43bp，-200~+43bp，来自于以白念珠菌ATCC10261染色体DNA为模板的PCR扩增产物，相应的重组体分别命名为pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR0.6、pHYR0.4、pHYR0.2。启动子5'端引物序列分别为：pHYR1.8：5'-CCGTCGACCCAATTCCCCCATTAGAACAC-3'; pHYR1.4：5'-CCGTCGACTTGGTTATGAACACTGCAACT-3';pHYR1.0：5'- C C G T C G A C A G A A A G G G A A AGGCGTGTAAGG-3';pHYR0.6：5'- CCGTCGACCACGAATACAATGGGAACACGA-3';pHYR0.4：5'- CCGTCGACGGCAAATGCTTAGTATGACAGC-3';pHYR0.2:5'-CCGTCGACCACACGCCTATTATATGCACAG-3'（pHYR1.8，1.4，1.0等是笔者为方便叙述而命名的重组体，该重组体的构建包括二部分，第一部分是扩增HYR1基因上游的DNA片段，共6段）。
上述6种重组体的3'端引物相同，序列为：5'-GCGTCGAGTGGTTTCAACAAACTGGAATACTT 3'端。两端引物分别含8个保护碱基和限制性内切酶SalI与XhoI酶识别位点，它们分别是SalI酶:CCGTCGAC;XhoI酶:GCGTCGAG。PCR按常规方法进行（PE-9600 PCR扩增仪）。取5μl产物电泳判断是否扩增成功，将扩增成功的产物用PCR产物回收试剂盒回收，并电泳估计其浓度。取1μg左右的产物用XhoI及SalI酶酶切并回收(标准酶切体系)，电泳估测浓度并保存。将含PNG17的菌用液体LB摇瓶约30ml培养过夜，用质粒小抽试剂盒抽提质粒并电泳检测浓度与质粒大小。取1μg左右的质粒用上述两酶酶切，碱性磷酸酶脱磷并胶回收，电泳估测浓度并保存。取合适量的已酶切的各目标片断与酶切的质粒载体用T4连接酶连接，4℃过夜。转化感受态大肠杆菌DH5α，涂板培养过夜。挑取转化子划线分离，并菌落PCR鉴定是否含有插入片断。将鉴定阳性的菌落小摇培养（3ml LB），抽提质粒，送测序。阳性克隆保种。
1.5 酵母菌EGY48的转化 将EGY48接种于YEPD液体培养基中(5ml)，培养过夜（16~18h），菌液离心（14k，30s），弃上清液，用1ml双蒸水洗涤1次，离心弃上清液。用1ml LiAC/TE洗涤1次，吸干剩余液体，振松菌体，加入50μl LiAC/TE，5μl鲑精DNA，1~2μl转化质粒，混匀，振动至无菌块，加入300μl LiAC/TE/PEG，振匀，置于30℃30min，再转置于42℃热激30min，再放回30℃5min，离心12k，1min，弃上清，加入100μl双蒸水，用枪吹打混匀，吸50μl于平板（SC-u/SGR-u）上涂布，30℃培养2~3天（48h以上）。
1.6 β-半乳糖苷酶(LacZ)活性的定性测定 在SC-u/SGR-u培养基（pH 7.0）中加入β-半乳糖苷（Xgal）1mg/ml和1%的脯氨酸，常规浇取petri培养皿。将SC-u/SGR-u平板上生长的酵母菌菌落接种其上，这些菌落为不同的酵母转化子，分别含有以上构建的6个重组体pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR0.6、pHYR0.4、pHYR0.2，设阳性对照，37℃培养48~72h后直接观察克隆是否能分解Xgal（变蓝色）。
2 结果
2.1 重组体的鉴定 以白念珠菌ATCC10261染色体DNA为模板，PCR扩增得到6个具有3'端的长短分别为200bp、400bp、600bp、1000bp、1400bp、1800bp的片段分别作为启动子，与不含启动子的载体PNG17组成重组体pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR0.6、pHYR0.4、pHYR0.2，这些重组体（图3）插入的片段相应于HYR1基因上游-1800~+43bp、-1400~+43bp、-1000~+43bp、-600~+43bp、-400~+43bp、-200~+43bp，经测序，插入片段与报道［1］的序列完全一致（测序结果未现）。
2.2 酵母转化子的建立 将6种重组体转化啤酒酵母EGY48，在SC-u/SGR-u培养基上30℃培养2~3天，可见酵母菌菌落生长，表明转化成功（图4），这些转化子分别含有重组体pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR0.6、pHYR0.4、pHYR0.2。