医药学论文：褪黑素替代治疗后去松果体大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的变化

【摘要】 目的 观察褪黑素替代治疗对去松果体成年大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区（SVZ）神经干细胞增殖的影响。方法 将30只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术、去松果体及褪黑素替代治疗3组，每组大鼠10只。在建立动物模型2天后开始用褪黑素（200μg/kg体重）或5%乙醇-生理盐水进行干预，每天在固定时间给予每只大鼠腹腔注射1次，连续给药21天。各组均于术后第16天开始用Morris水迷宫连续5天测定大鼠的学习记忆能力，用免疫组织化学方法观察SVZ的增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞变化。结果 去松果体组大鼠在Morris水迷宫游泳的逃避潜伏期及在原平台象限游泳距离的百分比明显延长或减少（P＜0.01）。去松果体大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核数也明显下降（P＜0.01）。褪黑素替代治疗后可明显逆转上述指标的变化，并使其接近假手术组大鼠的水平（P＜0.01）。假手术组与褪黑素替代治疗组间的指标差异无显著性（P＞0.05）。结论 本研究首次观察到，去松果体使体内褪黑素减少，可导致学习记忆功能及SVZ神经干细胞增殖能力出现相似的明显下降趋势，褪黑素替代治疗后可使上述指标出现相似的明显升高趋势并接近正常水平。说明褪黑素是确保学习记忆及神经发生得以正常进行的重要激素之一；提示褪黑素可能通过作用于局部神经干细胞以及星形胶质细胞上的相应受体的机制来促进神经干细胞增殖，使SVZ-吻侧迁移途径-嗅球的神经发生链在结构和功能上得到不断更新，进而提高学习记忆能力。
【关键词】 松果体； 褪黑素；替代治疗；学习记忆；室管膜下区；神经干细胞；增殖；大鼠


哺乳动物侧脑室室管膜下区（subventricular zone ，SVZ）是脑内终生存在神经发生（neurogenesis）的一个主要部位，由此产生的神经干细胞通过有丝分裂形成祖细胞（progenitor cell），后者迁移到嗅球，分化成新的中间神经元，代替衰老或死亡的神经细胞，使局部神经环路的结构得到不断更新，从而发挥正常的嗅觉及嗅觉记忆功能［1］。褪黑素是主要由松果体合成和分泌的一种神经内分泌激素，已证实其不仅具有促进胚胎个体发育及体外培养神经干细胞增殖的功能［2，3］，而且还可提高学习记忆能力［4］。然而，迄今仍匮乏有关褪黑素对成年在体SVZ神经发生及学习记忆影响的报道。为此，笔者最近进行了研究并初步观察到，松果体切除对成年大鼠SVZ神经发生及学习记忆均产生类似的负性效应［5］。为进一步揭示褪黑素、神经干细胞及学习记忆三者之间的内在联系，本研究通过观察褪黑素替代治疗对上述指标的影响模式，为阐明学习记忆的神经内分泌机制提供新的资料。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 小鼠抗人PCNA单克隆抗体为DAKO公司产品；生物素结合IgG、链霉菌抗生物素-过氧化酶（SP）及二氨基联苯胺（DAB）染色试剂盒均为福州迈新公司产品；褪黑素为Sigma公司产品。
1.2 动物与分组 选用清洁级健康雄性Sprague-Dawely大鼠30只，8～10周龄，体重150～180g，由广西医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为以下3组，每组10只：假手术、去松果体及褪黑素替代治疗组。
1.3 动物模型的建立 参照袁群芳等的方法［4］，进行松果体切除术，假手术除不切除松果体外，其余步骤与上述相同。所有动物在自然光暗周期的环境中分组饲养，自由饮水、进食。
1.4 替代治疗方法 术后第2天开始进行相应的干预，褪黑素替代治疗组的每只大鼠按200μg/kg 剂量将褪黑素溶于0.5ml的5%（V/V）乙醇-生理盐水中，每天在固定时间（18：00 pm）腹腔注射1次，连续给药21天。在相同条件下，每天给予假手术组和去松果体组的每只大鼠腹腔注射0.5ml的5%乙醇-生理盐水，连续注射21天。
1.5 学习记忆能力的测定
1.5.1 定位航行实验 于术后16天开始用Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所研制，型号：DMS-2）测试，历时4.5天，每天分上、下午2个时段，每只大鼠在每个时段测试4次，记录大鼠每次自入水直至找到并爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期，如60s找不到平台即记录为60s，以此作为判断大鼠学习能力的指标。
1.5.2 空间探索实验 在测试的第5天下午撤走平台，将大鼠放入水中，通过电脑测试系统记录大鼠在2min内的游泳轨迹，计算出大鼠在原平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比，以此作为判断大鼠记忆能力的指标。
1.6 组织切片制备 各组大鼠在完成测试学习记忆能力后，1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，经心脏灌注100ml 生理盐水，继之灌注500ml的4%多聚甲醛固定液（0.1mol/L PB液配制，pH 7.4，4℃）。除去颅盖骨，将头部固定于脑立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱［6］，在前囟前1.6mm至前囟后4.8mm的范围内切取脑组织块，置于相同的固定液后固定3h（4℃），转至30%蔗糖溶液（0.01mol/L PBS配制，pH 7.4，4℃），待组织块下沉后行冠状连续冰冻切片，片厚40μm，隔3取1，收集于0.01mol/L PBS中，待反应。
1.7 免疫组化反应 采用SP法检测SVZ的增殖细胞核抗原（proliferating cell nucleus antigen，PCNA）的表达，主要步骤如下：切片入3%（V/V）H2O2溶液室温15min，消除内源性过氧化物酶的活性；入0.1%（V/V）Triton X-100溶液（0.01 mol/L PBS配，pH 7.4）室温孵育1h；正常羊血清室温封闭抗原20min；小鼠抗人PCNA单克隆抗体（1:100）室温孵育22h；生物素结合IgG室温孵育2h；SP室温孵育2h；0.05%DAB（含0.01%（V/V）H2O2）室温显色约30s。在上述过程中，完成每一步骤后均用0.01mol/L PBS（pH 7.4）漂洗15min，然后再进行下一步骤。常规脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照实验除用羊血清代一抗外，其余步骤与上述相同。
1.8 细胞计数 每只动物选取3张切片（前囟前0.8mm、1.0mm、1.2mm）作为观察对象［6］，光镜下（40×10）计数左侧侧脑室SVZ的背侧、外侧及内侧3个视野的PCNA阳性细胞数。
1.9 数据统计分析 采用SPSS 10.0统计软件中的单因素方差分析对原始数据进行统计处理，用最小差异显著性检验（LST）及Games-Howell检验对数据进行两两比较，以双侧α=0.05作为显著性检验水准，最后得出的数据以x±s表示。
2 结果
2.1 Morris水迷宫测试结果 各组大鼠的逃避潜伏期及在原平台象限游泳距离的百分比分别见表1及图1。