医药学论文：链置换扩增术SDA及其进展

关键词： 链置换扩增术；DNA检测
摘要 链置换扩增术（strand displacement amplification,SDA）是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3'端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。本文主要介绍SDA的原理及其发展。
近几年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸（DNA或RNA）检测的诊断方法（如各种PCR、Southern杂交和Northern 杂交）已大量建立并获得广泛应用。这给临床诊断提供了快速、灵敏和准确的方法。虽然这些方法在临床实践中也遇到一些问题，如PCR的假阳性与假阴性问题，但基因诊断具有一些特殊优点，如：需样量少、快速灵敏和准确、应用范围广泛；因此，众多学者学者不断改进现有技术探索新方法。新技术如转录依赖的扩增系统（TAS）、自主序列复制（3SR）、循环探针反应、Qβ复制酶扩增法、快速导流杂交法、DNA凝集反应等陆续出现。SDA就是在这样的背景下产生发展起来的，与其它的DNA扩增技术相比，SDA有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。
2 SDA的原理
SDA中所用核酸内切酶的切割位点需专一，对识别位点的化学修饰敏感且在打开缺口后能立即解离让位于DNA聚合酶，如HincⅡ、HindⅡ；所用DNA聚合酶有链置换生活，但没有核酸外切酶活性（如cxo-Klenow）。因为3'→5'外切酶活性会使引物单链在反应中降解；5'→3'外切酶活性会使引物-靶序列杂交体中的5'悬端水解。DNA聚合酶需满足如下条件才能用于SDA反应：①无外切核酸酶活性；②于缺口处启动反应；③可利用dNTPas;④具有链置换活性。以上两种酶最好是耐热毒，如BsobⅠ和exo-Bca酶，以便提高SDA反应的温度以缩短反应时间、提高反应效率和提高SDA的特异性。应用BsoBⅠ和exo-Bca酶的SDA称嗜热SDA，能于20分钟内将靶DNA扩增1010倍，所用dNTP中有一种是经化学修饰的核苷酸（如dCTPas）一根据所用核酸内切酶的不同而不同。采用修饰核苷酸的目的是在SDA中形成修饰的核酸内切酶识别位点，使核酸内切酶不能切断双链DNA而只将其打开缺口。所用两对引物（B1，B2与S1，S2）中有一对（B1，B2）只含与靶片段互补的序列，而另一对（S1，S2）除含与靶片段互补的序列外，还在其5'端含所用核酸内切酶的识别序列（如BsoBⅠ的识别序列为5'-TCGGG），且S1（S2）在模板上的结合位点位于模板上B1（B2）结合位点的5'侧。
2.2两端带酶切位点的目的DNA片段的生成该阶段通过3次引物延伸和2次置换反应，以单链DNA为模板制备两端酶