医药学论文：海藻硫酸多糖的制备及其抗凝血活性的研究进展

海藻硫酸多糖的制备及其抗凝血活性的研究进展

　　摘要:海藻硫酸多糖是从海藻中提取的一类生物活性多糖,迄今已提取出多种具有抗凝血活性的海藻硫酸多糖,它作为一种有望替代肝素的新型抗凝血活性物质日益受到关注。现就目前国内外对海藻硫酸多糖的制备及其抗凝活性的研究进展作一综述。

　　关键词:海藻;硫酸多糖;抗凝血

　　中图分类号:R282.77文献标识码:A文章编号:1672-979X(2007)08-0054-03

　　海藻硫酸多糖 (sulfated polysaccharide form seaweed,SPS)是从海藻中提取的多糖硫酸化衍生物,是多糖分子链中单糖分子的部分羟基被硫酸根取代而形成的一类多功能活性物质,由不同的单糖基通过糖苷键(一般为C1,3-键和C1,4-键)相连而成。SPS的来源不同,其糖基单体及硫酸基的位置也不相同。研究表明,SPS具有抗肿瘤、抗病毒、降血脂、降血糖、抗凝血以及增强机体免疫机能等生物学活性,日益受到关注。目前常用的抗凝药物是从动物体中获得的肝素,其来源有一定限制。SPS抗凝血活性显着,来源广泛且无副作用,有望代替肝素成为新型的抗凝血药物。临床资料表明,SPS对缺血性心脑血管疾病及高血黏度综合征有明显的抗凝、解痉、解聚、降压降脂、降低血液黏度以及扩张血管、改善微循环的作用。

　　1.SPS的来源

　　1913年Killing 首次从褐藻中提取了具有抗凝血活性的SPS,1957年Springer等报道,从墨角藻中分离到的褐藻多糖硫酸酯在体内和体外都表现出了强抗凝血活性。1958年Gerber从胶质石花菜(Gelidium cartiagenium)中提取了呈高度硫酸化的SPS。在很长一段时间内人们认为,具有抗凝血活性的硫酸多糖主要是从褐藻中提取的岩藻聚糖和从红藻中提取的卡拉胶,绿藻中没有抗凝血硫酸多糖。直到1985年Deacon报道,绿藻Codium fragile ssp. tomentosides中有抗凝血活性多糖,人们才开始将目光转向绿藻,并从刚毛藻、蕨藻、孔石莼等绿藻中发现了含量很高的硫酸多糖。表明硫酸多糖在海藻中普遍存在,来源非常广泛。

　　2.SPS的制备

　　SPS制备的主要工艺环节包括破碎、浸提、沉淀、纯化、水解等。浸提及沉淀是影响收率、产品质量及经济性的主要环节,纯化与水解则是关系到其生理活性的重要因素。

　　2.1粗多糖的制备

　　目前制备粗多糖多用水提醇沉法。通常是用热水浸提破碎的海藻,离心得到上清液,浓缩并加入60%~75%乙醇沉淀多糖。离心后再用乙醚、丙酮、无水乙醇等反复洗涤,干燥即得粗多糖。也可用微波、超声波以及反复冻融等方法辅助提取,以提高多糖的提取率并缩短提取时间。此外,还可用稀酸、稀盐溶液提取或复合酶-热水浸提相结合的方法提取,但提取条件不能过分强烈以免破坏其天然高级结构,或造成硫酸基团脱落而丧失生物活性。提取硫酸多糖一般不用碱溶液,因为碱处理易使SPS的硫酸基团脱落,用稀酸提取则不存在这个问题。吴永沛[1]报道,提取福建产海带岩藻聚糖的条件是用8倍0.1mol/L 盐酸提取2 h,70%乙醇沉淀精制,岩藻聚糖的提取率为2.1%,产品SO42-含量为20%。工艺条件温和,不使用有害元素或化学品,产品安全度高、生物活性强。酶法提取多用纤维素酶或果胶酶使细胞破壁以提高收率,酶解法具有条件温和、杂质易除去等优点。

　　提取液含有褐藻胶时,可先用低浓度的乙醇沉淀褐藻胶,再用高浓度的乙醇沉淀硫酸多糖。还可用氢氧化铅、氢氧化铝以及季胺盐类阳离子表面活性剂沉淀多糖。

　　2.2硫酸多糖的纯化

　　沉淀所获得的多糖常含有较多的蛋白质,可选用Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法或是蛋白酶水解法脱去蛋白质,得到多糖粗品。Sevag法操作繁琐,多糖损失量大,且有有机溶剂残留;三氯醋酸法反应剧烈,易使糖苷键断裂;蛋白酶法不仅脱蛋白效率高而反应条件温和,多糖不易破坏或损失。文献[2]报道,用碱性蛋白酶脱除多糖中的蛋白质,脱除率可达86.4%,多糖收率为89.3%;Sevag法的蛋白质脱除率虽然达87.9%,但多糖收率仅为28.6%。

　　进一步的分离纯化多采用色谱柱层析法,纯化硫酸多糖多用弱阴离子交换柱层析,如DEAE-cellulose-52[3],DEAE -Sepharose F F[4]等。根据所带电荷的不同可用不同浓度的盐溶液分离硫酸多糖,然后根据相对分子质量大小用葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶柱层析进一步分离纯化。Yasantha[5]研究褐藻Ecklonia cava 硫酸多糖的抗凝血活性时,使用两次DEAE-纤维素层析柱得到单一的洗脱峰,再用Sepharose 4B柱层析再次纯化,经琼脂糖凝胶电泳检测为相对单一的组分。

　　2.3SPS的水解

　　天然的SPS是一种含有多种单糖和硫酸基的水溶性杂多糖,其相对分子质量从几万至几十万不等,结构复杂,难吸收。用适当的方法降低海藻硫酸多糖的相对分子质量,是亟待解决的问题。降解SPS可用酸解法、碱解法、盐解法、酶解法、超声波降解和射线降解,但这些方法对多糖的降解大都是随机的,所得降解产物相对分子质量范围较大;专一性的糖苷酶因价格昂贵不适合大规模工业生产。王琪琳等[6]用自由基方法降解海带硫酸多糖,可使多糖的相对分子质量降低到1万左右,不但相对分子质量很集中,而且降解之后海带硫酸多糖的多糖含量、硫酸根含量均增加,而单糖组成及多糖结构基本没有变化;Elisa[7]用H2O2降解Schizymenia binderi中的硫酸多糖,得到相对分子质量约8.5×103的片断,且具有抗凝血活性;马夏军[8]用超声波辅助H2O2降解麒麟菜硫酸多糖,降解后不需处理氧化剂,相对分子质量为5×103~4×104,水溶性明显增强,且活性基团得以较好地保留。

　　3.SPS多糖抗凝血作用机制

　　SPS抗凝血的机制与肝素类似,它能提高抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的活性,抑制凝血过程中必需的丝氨酸蛋白酶、凝血酶和活化因子(FXa)的活性。Church [9]的研究表明,岩藻聚糖浓度为10μg/mL时可激活肝素辅助因子Ⅱ(HCⅡ),使HCⅡ介导的抗凝血酶活性提高超过3 500倍,而对的AT Ⅲ介导凝血酶的活化因子无太大影响,表明岩藻聚糖主要通过增强HCⅡ发挥了抗凝血的作用;Takashi[10]认为,昆布硫酸多糖能显着抑制内源性途径和外源性途径凝血酶的产生,它主要是抑制凝血酶的产生过程,而不是抑制凝血酶的活性。此外,还有研究表明,低相对分子质量岩藻糖可加强AT Ⅲ和HCⅡ对凝血酶的抑制作用[11];从绿藻Codium cylindricum 中提取的硫酸半乳糖体虽没有增强AT Ⅲ和HCⅡ的活性,但可以直接抑制凝血酶活性以及血纤维蛋白的聚合[12]。